【摘要】：寨卡(ZIKA)由寨卡病毒(ZIKA virus,ZIKV)感染引起的,是21世紀最具破壞性的傳染性疾病威脅之一。ZIKV作為一種新興蚊媒傳播病毒,2007年以前主要表現(xiàn)為散發(fā)型,2007年在密克羅西亞的雅浦島引起了重大疫情。自2015年該病毒傳染至巴西以來,病毒迅速蔓延至南美洲、拉丁美洲、非洲、東南亞、太平島等地區(qū)。ZIKV感染可引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病,包括小頭畸形和格林-巴利綜合征,截止2017年世衛(wèi)組織報告了84個具有寨卡病毒傳播的國家或地區(qū),急需開發(fā)安全有效的寨卡疫苗。DNA疫苗又稱基因疫苗或核酸疫苗,使外源基因在活體內(nèi)表達,產(chǎn)生的抗原激活機體的免疫系統(tǒng),從而誘導特異性的體液免疫和細胞免疫應答。與傳統(tǒng)疫苗相比基因疫苗具有一些優(yōu)越性:質(zhì)粒DNA非常穩(wěn)定,使用方便,應用較安全;制備簡單,容易大量生產(chǎn),成本低,易于貯存和運輸;能夠產(chǎn)生持久的免疫應答,免疫保護力增強;可以插入不同的保護性抗原基因,構(gòu)成多價或多聯(lián)疫苗等。佐劑是與抗原或與抗原混合注入機體后,能夠增強機體對抗原的免疫應答或者改變免疫反應的類型,屬于非特異性的免疫增強劑,而其本身無抗原性。本實驗以BALB/c小鼠為實驗模型,選用了6種佐劑,將其中2種具有遞送功能的刺激物與其余4種成份組合成不同佐劑配方。然后與構(gòu)建的表達載體DNA疫苗聯(lián)合免疫小鼠,同時設立對照組,分析其免疫效果。本研究以pVAX1為載體表達ZIKV E、ME保護性抗原為候選疫苗,并進行小鼠免疫原性分析。根據(jù)GenBank上已公布的ZIKA基因序列合成ME基因(KU365780)。PCR擴增E、ME蛋白基因,經(jīng)比對測序結(jié)果正確后,連接到pVAX1載體上,構(gòu)建表達目的蛋白的DNA疫苗。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細胞,采用Western blot檢測目的蛋白的表達。結(jié)果顯示所構(gòu)建的DNA疫苗在56及68kDa成功表達了E、ME蛋白。本實驗通過小鼠免疫實驗,分析不同佐劑組合對DNA候選疫苗免疫原性的影響,T細胞亞群檢測表明疫苗免疫組,CD3~+CD4~+T、CD3~+CD8~+T淋巴細胞亞型數(shù)量高于PBS組;T淋巴細胞增殖實驗結(jié)果表明含佐劑疫苗免疫組顯著高于PBS對照組(P0.05);ELISA抗體檢測結(jié)果顯示疫苗組能夠誘導機體產(chǎn)生較高于PBS對照組的特異性抗體水平;細胞因子檢測顯示含佐劑組的IL-4及IFN-γ含量顯著高于不含佐劑疫苗組(p0.05)。說明所構(gòu)建的DNA疫苗能夠誘導機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫,并且初步篩選出兩組對ZikaE、ZikaME的DNA候選疫苗有顯著提高作用的新型疫苗佐劑,為寨卡疫苗佐劑的選擇提供基礎。
【學位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.4
【圖文】：

還可以通過性接觸直接在人與人之間傳播，也可從母親垂直傳播到胎兒。迄今為止，與其他新出現(xiàn)的蟲媒病毒相比如黃熱病，登革熱（DENV），西尼羅河（WNV），流行性乙型腦炎（JEV）和基孔肯雅病毒（CHIKV），ZIKV 感染的生物學仍然知之甚少[7]。1.1 ZIKV 基因組學黃病毒屬的特征，ZIKV 具有 11kb 的正鏈 RNA 基因組，其由單個開放閱讀框組成，長度為 10794bp，其側(cè)翼為 5'和 3'非翻譯區(qū)（UTR）[8]。ORF 編碼 3423個氨基酸（aa）的單個大的多蛋白，隨后在宿主和病毒蛋白酶翻譯后被切割成三個結(jié)構(gòu)蛋白，包膜 E（~500 aa），膜前體 prM（~168 aa）和衣殼 C（~122 aa），這三種結(jié)構(gòu)蛋白是形成感染性病毒粒子所必需的。以及七種非結(jié)構(gòu)蛋白 NS1（~352aa），NS2A（~226 aa），NS2B（~130 aa），NS3（~617aa），NS4A（~152 aa），NS4B（~251 aa）和 NS5（~903aa），是病毒復制和組裝所必需的[9]，結(jié)構(gòu)示意圖見圖 1.1。

和受體相互作用然后病毒包膜和細胞內(nèi)膜之間的融合過程允許黃病毒進入靶細胞。晶體結(jié)構(gòu)顯示 E 蛋白含有獨特的帶正電荷的貼片，可能影響宿主的附著。ZIKV E 蛋白具有 “人字形”特征性的結(jié)構(gòu)，單體 E 由三個不同的結(jié)構(gòu)域組成：DI，DII 和 DIII。指狀 DII 含有融合環(huán)（FL），其在 pH 依賴性構(gòu)象變化期間內(nèi)體膜驅(qū)動融合，插入宿主細[11]。E 蛋白單糖基化位點（Asn154），位于 E 殘基與鄰近的 E 蛋白融合肽相鄰的環(huán)上，可以控制溶劑進入融合循環(huán)。此外，E 蛋白也是通過識別 ZIKV E 蛋白融合環(huán)區(qū)域抗體的主要靶標。E 蛋白在寨卡病毒入侵細胞起至關重要的作用，是參與受體結(jié)合和融合的主要蛋白質(zhì)，在病毒顆粒表面形成頭對尾二聚體。并能誘導機體免疫應答，該蛋白被看成是亞單位疫苗或重組疫苗的首選目的蛋白[12]。M 蛋白（~75aa）或 prM 蛋白（~165aa），M 蛋白是一種隱藏在 E 蛋白層下的小蛋白質(zhì)。M 蛋白由含一個螺旋的莖、兩個螺旋的跨膜區(qū)及 N 端的 M 環(huán)形成。prM 參與膜蛋白折疊，可防止與宿主膜 過早融合，被切割成 M 蛋白及 pr 肽。表面蛋白質(zhì)以二十面體狀對稱排列，由 60 個重復的 E 和 M 蛋白單元組成，病毒顆粒由脂質(zhì)包膜包圍二十面體衣殼組成，直徑為 40-70nm[13]（圖 1.2）。

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