【摘要】：端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(TERT)編碼的蛋白是組成端粒酶的三個(gè)主要成分之一,是端粒酶活性的限速單位。端粒酶通過(guò)在端粒末端補(bǔ)充“TTAGGG”重復(fù)序列阻止細(xì)胞復(fù)制性衰老。本研究檢測(cè)了鴨TERT(dTERT),相對(duì)端粒酶活性(RTA)和相對(duì)端粒長(zhǎng)度(RTL)在鴨早期發(fā)育階段的時(shí)空分布特點(diǎn)�？寺×锁員ERT 5'-側(cè)翼序列,研究了表觀遺傳特別是DNA甲基化對(duì)dTERT表達(dá)的調(diào)控作用。最后,基于雙熒光素酶活性檢測(cè)和生物信息學(xué)分析,選擇靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的近端調(diào)控區(qū)作為靶序列,利用CRISPR-Cas9技術(shù)內(nèi)源性激活了鴨小腸上皮細(xì)胞中的TERT。結(jié)果如下:1.鴨TERTmRNA,相對(duì)端粒酶活性(RTA)和相對(duì)端粒長(zhǎng)度(RTL)的時(shí)空分布特點(diǎn)在出生后7天雛鴨的所有8個(gè)測(cè)試組織(心臟、肝臟、脾臟、腎臟、小腸、腿肌、性腺和胰腺)中均檢測(cè)到了TERTmRNA的表達(dá)。其中,TERT在小腸和腎臟中的表達(dá)水平最高,其次依次是心臟、腿肌、脾臟、胰腺,在性腺和肝臟中的表達(dá)水平最低。在肝臟發(fā)育過(guò)程中,dTERT的表達(dá)趨勢(shì)先從E13(胚胎期13天)到E19增加,然后從E19到E26急劇下降,并在D7(出生后7天)達(dá)到最低水平。而在腿肌中,dTERT的表達(dá)水平從E13到E19變化不大,從E19到E26顯著增加,從E26到D7明顯減少。在所有測(cè)試的雛鴨(D7)組織中均檢測(cè)到了相對(duì)端粒酶活性(RTA),其中小腸中的端粒酶活性特別高,腎臟、心臟和胰腺中的端粒酶活性相對(duì)較低,端粒酶活性表現(xiàn)最低的是肝臟和腿肌。隨著胚胎的發(fā)育,肝臟和腿肌中的RTA水平均顯著下降。此外,雛鴨(D7)腿肌中的相對(duì)端粒長(zhǎng)度(RTL)最長(zhǎng),其次是腎臟、小腸、肝臟、心臟和胰腺。從胚胎發(fā)育到出生階段,肝臟中的RTL從E13到E26相對(duì)穩(wěn)定,到D7時(shí)明顯縮短。在腿肌中,RTL從E13到E26有小幅度的增加,而到D7時(shí)也顯著縮短。2.鴨TERT 5’-側(cè)翼序列的克隆及DNA甲基化調(diào)控研究克隆獲得了2,413bp長(zhǎng)的dTERT 5'-側(cè)翼序列,并提交給GenBank(GenBank No.MH910094)。5'-RACE將轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)定位到了-93bp處,定義為新的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(+1)。生物信息學(xué)分析顯示,鴨TERT5'調(diào)控區(qū)有三個(gè)CpG島(S1,S2和S3)。亞硫酸氫鹽測(cè)序PCR(BSP)結(jié)果表明,與小腸(D7)或肝臟(E19)相比,dTERTmRNA表達(dá)量顯著較低的肝臟(D7)在S1區(qū)具有更高的甲基化水平。熒光定量PCR結(jié)果顯示,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1表達(dá)水平在肝臟(D7)中顯著高于其他兩個(gè)組織。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,經(jīng)過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-2'-deoxycytidine(5-aza-dC)處理后,鴨胚成纖維細(xì)胞(DEFs)和小腸上皮細(xì)胞(DIECs)中dTERT表達(dá)均顯著增加,同時(shí)S1區(qū)的甲基化水平顯著降低,上述實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了dTERT受到DNA甲基化的表觀遺傳調(diào)控。此外,用組蛋白去乙酰化酶抑制劑trichostatinA(TSA)處理DEFs和DIECs后,也導(dǎo)致dTERT表達(dá)顯著增加,提示組蛋白乙�；部赡軈⑴c鴨TERT的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。3.利用CRISPR-Cas9技術(shù)內(nèi)源性激活鴨TERT雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(+1)上游541bp是鴨TERT的核心啟動(dòng)子區(qū),結(jié)合潛在轉(zhuǎn)錄因子位點(diǎn)的生物信息學(xué)分析,將-370/-150作為CRISPR/Cas9基因編輯的靶序列。用慢病毒法將10種Cas9-sgRNAs混合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DIECs后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞,當(dāng)培養(yǎng)到編輯后第5代時(shí)(CRISPR 5P)鴨TERT的表達(dá)有輕微上調(diào)。隨著傳代的進(jìn)行,dTERT轉(zhuǎn)錄逐漸增強(qiáng),直到在CRISPR13P時(shí)維持一個(gè)穩(wěn)定的水平。當(dāng)未編輯的DIECs進(jìn)入衰老停滯時(shí),CRISPR編輯的DIECs依然具有良好的細(xì)胞形態(tài)和增殖活性。Sanger測(cè)序顯示,CRISPR 5P DIECs中所有sgRNAs都成功整合進(jìn)鴨基因組,靶區(qū)域呈現(xiàn)出不同形式的基因突變。當(dāng)培養(yǎng)到編輯后18代時(shí),存活的CRISPR 18PDIECs中的優(yōu)勢(shì)突變是靶序列上74bp的缺失,而優(yōu)勢(shì)sgRNAs是sgRNAs2,sgRNAs7和sgRNAs9。檢測(cè)RTA和RTL發(fā)現(xiàn),CRIPSR編輯的DIECs中RTA被成功激活,但是并沒(méi)有阻止端粒的縮短。熒光定量TERT潛在的靶基因表明,dTERT可能以一種端粒非依賴(lài)方式通過(guò)抑制衰老凋亡相關(guān)基因來(lái)維持細(xì)胞生長(zhǎng)。最后,用LPS和poly(I:C)處理表明,CRISPR編輯的TERT被成功激活的鴨小腸上皮細(xì)胞依然具有正常的免疫反應(yīng)功能。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S834
【圖文】：

領(lǐng)域做出開(kāi)拓性工作的很多年后，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，邋Ｇｒｅｉｄｅｒ和Ｓｚｏｓｔａｋ分享了諾貝爾生逡逑理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)（Ａｂｂｏｔｔ，２００９）。從開(kāi)始研宄端粒至今，端粒和端粒酶領(lǐng)域發(fā)表了很逡逑多突破性工作，羅列在圖１．１中。逡逑．Ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ邐Ｔｅｔｏｍｅｒａｓｅ逡逑Ｍｕｌｌｅｒ邋－邋ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｅｌｏｍｅｒｅ４７逡逑ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ：邋ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ邋ａｒｅ邋ｎａｔｕｒａｌ邋ｅｎｄｓ，，，Ｓ４＇邋■逡逑Ｈａｙｆｌｉｃｋ邋ｌｉｍｉｔ：邋ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ邋ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ＊？逡逑Ｗａｔｓｏｎ：邋ｔｅｌｏｍｅｒｅ邋ｅｎｄ邋ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｂｌｅｍ＇＇逡逑，邐．．．邐＞ｖ＇ＩＨ邐Ｔｅｒｍｉｎａｌ邋ｔｅｌｏｍｅｒｅ邋ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ，＇逡逑0邐Ｈｕｍａｎ邋ｔｅｌ0ｆＷｒ？邋ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ－逡逑Ｔｅｌｏｍｅｒｅ邋ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｙｅａｓｔ＊＇＇逡逑Ｔｅ．ｏ．ｅｒａ．ｅ．ｄｅｎｔｉｆｉｅｄｉｎＨｅＬａｃｅＵ＾逡逑Ｔｅｌｏｍｅｒｅ邋ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ邋ｉｎ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｈｕｍａｎ邋ｃｅｌｌｓ－

Ｃ的滯后鏈和一條富含Ｇ的前導(dǎo)鏈。端粒一般通過(guò)兩種方式避免線性端被識(shí)別為需要修復(fù)的ＤＮＡ損傷信號(hào)。一是將前導(dǎo)鏈３’端突出的單ＧＧ）ｎ重復(fù)序列插入到雙鏈（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ重復(fù)序列中去，形成－個(gè)類(lèi)似套，稱(chēng)為端粒環(huán)（或簡(jiǎn)稱(chēng)為ｔ－環(huán)），這樣染色體就不存在游離的末端（Ｇｒｉｆｆｉｔ１９９９）：二是與蛋白質(zhì)復(fù)合物“Ｓｈｅｌｔｅｒｉｎ’’相結(jié)合，使ｔ－環(huán)更加穩(wěn)固（Ｄｅ邋Ｌａｎｇｅ�！埃樱瑁澹欤簦澹颍椋睢睆�(fù)合物由６種蛋白組成：端粒重復(fù)結(jié)合因子１邋（ＴＲＦ１），端合因子２邋（ＴＲＦ２），ＴＲＦ２互作蛋白（ＲＡＰ１），ＴＲＦ１互作核因子２邋（ＴＩＮ２）皮質(zhì)發(fā)育不良蛋白同源物（ＡＣＤ，也稱(chēng)為ＴＰＰ１，ＰＩＰ１或ＰＴＯＰ）和端粒１邋（ＰＯＴ１邋）。ＴＲＦ１和ＴＲＦ２都與端粒雙鏈序列結(jié)合，并且都與ＴＩＮ２蛋其中ＴＲＦ２還與ＲＡＰ１蛋白互作。ＰＯＴＩ與單鏈ＴＴＡＧＧＧ重復(fù)序列結(jié)合，逡逑結(jié)合配偶體ＡＣＤ與ＴＲＦ１，邋ＴＲＦ２相互作用，其中ＡＣＤ與ＴＩＮ２結(jié)合（Ｂａｕｍａｎｎ邋ａｎｄ邋Ｃｅｃｈ，邋２００１；邋Ｂｉａｎｃｈｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋１９９７；邋Ｂｉｌａｕｄ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋１９９７；邋Ｚｈｏｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．

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本文編號(hào)：2717779