本文關鍵詞：鴨坦布蘇病毒E蛋白關鍵毒力位點的發(fā)現(xiàn)與鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：2010年于我國東南部沿海地區(qū)鴨養(yǎng)殖區(qū)爆發(fā)了抗原為鴨坦布蘇病毒的傳染性疾病,后來迅速流行于全國各地的主要鴨養(yǎng)殖區(qū)等(浙江、廣州、廣西、安徽、江蘇、山東、河北)。鴨群被感染后,癥狀表現(xiàn)產(chǎn)蛋下降、采食量降低、生長緩慢和典型的神經(jīng)癥狀,鴨群感染率為100%,死亡率高達10~30%,對我國的鴨養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失和對公共衛(wèi)生安全產(chǎn)生了安全隱患。鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV),屬于黃病毒科,黃病毒屬。黃病毒屬包括乙型腦炎病毒(Janpanese encephalitis virus,JEV)、登革熱病毒(Dengue virus,DENV)、西尼羅病毒(West Nile virus)、黃熱病毒(yellow fever virus)等等。DTMUV基因是一條正鏈RNA,包含兩端的非編碼區(qū)(5’-UTR和3’UTR)和一個開放讀碼框,分別編碼結構蛋白:衣殼蛋白(C)、膜蛋白前體/膜蛋白(pr M/M)和包膜糖蛋白(E),7個非結構蛋白。目前已經(jīng)從雞、鵝、鴿子、鳥和蚊子體內(nèi)分離出了此病毒,說明了DTMUV很可能已經(jīng)獲得了跨種傳播的能力。根據(jù)最新研究DTMUV在哺乳動物細胞上連續(xù)傳代、小鼠體內(nèi)正常復制尤其是肝、脾臟、腦等部位,小鼠臨床癥狀比較明顯,表現(xiàn)為黃病毒中典型的神經(jīng)癥狀。另外由于黃病毒為人畜工感染的重要病原,而DTMUV也可通過蚊蟲傳播,所以其很可能是一種潛在的人類病原體,非常有必要做好DTMUV的跨種傳播感染人預防工作,研究其致病性和開發(fā)新的疫苗。本研究是通過探尋DTMUV中關鍵毒力位點,來探究DTMUV的致病機制和減毒策略,給減毒活疫苗的研制提供新的減毒靶點,為DTMUV的爆發(fā)流行和跨種傳播人做好預防工作本研究主要包括四部分:一、DTMUV病毒的毒力位點分析與鑒定本實驗通過小鼠顱內(nèi)連續(xù)傳代DTMUV病毒,發(fā)現(xiàn)了病毒的蝕斑能力出現(xiàn)了減弱的生物學。通過蝕斑純化技術,分離出DTMUV-L與DTMUV-S,發(fā)現(xiàn)DTMUV-S的蝕斑能力和神經(jīng)毒力有明顯減弱的現(xiàn)象。通過核苷酸序列比對發(fā)現(xiàn),突變病毒的在E 388位有一個絲氨酸(S)到精氨酸(R)的突變,其他核苷酸的突變位于非結構蛋白NS1和NS5中。根據(jù)有關研究證明,黃病毒屬中的E蛋白是病毒關鍵的毒力部位,在病毒感染過程中具有細胞吸附、膜融合等重要作用,包含多種抗原表位,是中和抗體結合的區(qū)域,所以確定了E蛋白388位突變位點的研究路線。二、突變感染性克隆p S388R的構建本實驗室已將DTMUV的結構基因pr M和E基因嵌合在乙腦病毒的感染性克隆載體上E70上,構建了嵌合感染性克隆p CJDTMUV。為探究該E388突變是否對鴨坦布蘇病毒的生物學特征有影響,在感染性克隆質粒p CJDTMUV基礎之上,本實驗利用分子克隆技術,將E388位氨基酸由S突變?yōu)镽,構建了攜帶突變位點的感染性克隆質粒p S388R,并成功拯救獲得攜帶該突變的恢復病毒r S388R。三、恢復病毒r S388R與親本病毒r WT株病毒的體外病毒特征對比本研究評價了恢復病毒r S388R體外水平的生物學特征。生長曲線上BHK-21、C6/36和SY-SH5Y細胞上沒有明顯的差異,但是在Vero,DF-1細胞系中發(fā)現(xiàn)r S388R的生長曲線明顯減弱;蝕斑形態(tài)上看r S388R病毒的蝕斑明顯減小;間接免疫熒光實驗表明兩株病毒在表達自身結構蛋白上沒有明顯差異;溫度穩(wěn)定性實驗發(fā)現(xiàn)r S388R對溫度的變化更加敏感,病毒的結構穩(wěn)定性變?nèi)?病毒的吸附實驗表明兩株病毒沒有明顯的差異,但肝素受體結合實驗中發(fā)現(xiàn)攜帶S388R突變的病毒是依賴于結合宿主細胞中的硫酸乙酰肝素(HS)受體來完成病毒感染過程。四、恢復病毒r S388R與親本病毒r WT的動物水平的評價動物實驗結果說明r S388R病毒株的神經(jīng)毒力和神經(jīng)侵襲力都明顯弱于r WT親本株,能夠有效的誘導機體產(chǎn)生Ig G抗體和中和抗體,而且具有良好的免疫保護結果。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)并探究了鴨坦布蘇病毒E388突變對病毒生物學特征和致病機制的影響,構建了攜帶突變位點的感染性克隆,證明了S88R的突變對鴨坦布蘇病毒是具有非常重要影響的,為病毒的疫苗研制提供了新的策略。
【關鍵詞】：鴨坦布蘇病毒 黃病毒 感染性克隆 E蛋白 減毒疫苗
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-9
• 英文縮略詞表9-10
• 前言10-15
• 第一部分 鴨坦布蘇病毒的毒力位點鑒定與分析15-26
• 1. 材料與方法15-16
• 2.方法16-20
• 3 結果20-24
• 4．討論24-26
• 第二部分 攜帶 S388R 突變位點的感染性克隆構建以攜帶 S388R 突變位點的感染性克隆構建以26-40
• 前言26
• 1 材料與試劑26-28
• 2．方法28-33
• 3 結果33-39
• 4.討論39-40
• 第三部分 恢復病毒的體外生物學特征研究40-53
• 前言40
• 1 材料與試劑40-41
• 2 方法41-44
• 3 結果44-51
• 4.討論51-53
• 第四部分 恢復病毒的體內(nèi)水平實驗53-62
• 前言53
• 1 材料與試劑53
• 2 方法53-56
• 3．結果56-61
• 4.討論61-62
• 結論62-64
• 參考文獻64-67
• 附錄67-68
• 攻讀碩士學位期間研究成果68-69
• 致謝69-71
• 綜述71-78
• 參考文獻77-78

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 邢文靜;李洪;;流行性乙型腦炎病毒E蛋白基因的克隆及高效表達研究進展[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2009年06期

2 魏惠永,江麗芳,薛耀華,郭輝玉;登革2型病毒E蛋白在酵母菌中的分泌表達[J];中國病毒學;2002年03期

3 陳慧慧;仲飛;李秀錦;張考;李文艷;溫潔霞;;慢病毒載體介導豬繁殖與呼吸綜合征病毒E蛋白在豬肺泡巨噬細胞中的表達[J];畜牧與獸醫(yī);2012年S1期

4 田志平;薛江東;霍曉偉;劉鍇;王學理;楊明霞;馬_郴，

本文編號：271709