發(fā)布時間：2020-06-17 04:30

【摘要】：禽流感(Avian Influenza,AI)和新城疫(Newcastle Disease,ND)是兩類嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的動物重要傳染病,它們的病原分別是禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)和新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)。對這兩種疫病的預(yù)防和控制,疫苗接種仍是主要手段。H9N2亞型AIV屬于低致病型病毒,在感染雞群后,僅引起輕微的呼吸道癥狀和產(chǎn)蛋率下降,但與其它病原混合感染時會產(chǎn)生致病協(xié)同作用,從而造成較高的死亡率。H9N2亞型AI在我國流行的20多年期間,給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的危害。NDV是單股負鏈RNA病毒,在反向遺傳學(xué)技術(shù)的推動下,用其作為外源基因表達載體的研究迅速發(fā)展,研究證明,NDV作為外源基因表達載體構(gòu)建的活載體疫苗,可以誘導(dǎo)動物的體液免疫和細胞免疫,可以在動物體內(nèi)增殖并長期表達抗原基因,也不與宿主基因組整合,安全高效。本研究在實驗室前期建立的新型耐熱NDV弱毒株反向遺傳學(xué)平臺NDV-rAHR09的基礎(chǔ)上,構(gòu)建一種熱穩(wěn)定的基因VIII型NDV弱毒株外源基因表達載體,進一步利用該載體表達H9亞型AIV的血凝素(Hemagglutinin,HA)基因,創(chuàng)制熱穩(wěn)定的H9亞型AIV重組疫苗候選株,并對其免疫效力進行評價。1.熱穩(wěn)定的基因VIII型新城疫弱毒株外源基因表達載體的構(gòu)建以熱穩(wěn)定的NDV-rAHR09反向遺傳平臺為基礎(chǔ),在已構(gòu)建的全長重組質(zhì)粒P和M基因間隔區(qū)引入酶切位點PmeI,作為外源基因插入位點,構(gòu)建了 rAHR09-P表達載體。通過無縫克隆的方法插入EGFP報告基因,構(gòu)建了 p-rAHR09-EGFP-l轉(zhuǎn)錄載體,經(jīng)拯救獲得能夠穩(wěn)定表達EGFP基因的重組病毒NDV-rAHR09-EGFP-l。經(jīng)測定,該重組病毒生長特性、熱穩(wěn)定性和毒力等與親本弱毒株相比均無顯著變化。2.表達H9亞型禽流感病毒HA基因的耐熱重組新城疫病毒的構(gòu)建本研究構(gòu)建了三種形式的重組病毒,分別為rAHR09-H9HA-O、rAHR09-H9HA-Q、rAHR09-H9HA-T。重組病毒 rAHR09-H9HA-O 表達了 H9N2 亞型 AIV 毒株 YZ1406 的 HA蛋白,重組病毒rAHR09-H9HA-Q表達的HA蛋白缺失了跨膜區(qū),重組病毒rAHR09-H9H A-T表達的HA蛋白替換了 NDVF蛋白的跨膜區(qū)。3株重組病毒在雞胚上均能夠穩(wěn)定生長,血凝滴度能達到28以上。在雞胚上連續(xù)傳15代后,對其耐熱性進行測定,結(jié)果顯示:3株重組病毒均有較好的熱穩(wěn)定性,經(jīng)56℃處理90 min以上仍有血凝活性。3株獲救的重組病毒MDT值均大于120h,ICPI指數(shù)均小于親本病毒,經(jīng)與原NDV弱毒株比較,證I明外源基因的插入沒有影響重組病毒的毒力。3.3種重組病毒疫苗候選株免疫效力評價75只7日齡SPF雞隨機平均分成5組,分別為3個重組病毒免疫組、新城疫-禽流感二聯(lián)滅活苗免疫組和非免疫對照組。重組病毒免疫采用滴鼻點眼的方式,免疫劑量為106 EID50;滅活苗免疫采用肌肉注射的方式,免疫劑量為0.2 mL。免疫21天后,以滴鼻點眼的方式進行攻毒,攻毒毒株為H9亞型AIV(YZ1406株),劑量為108EID50。免疫后第7、14、21、28天測定各組實驗雞血清中H9的抗體效價。結(jié)果表明,重組病毒組在接種后抗體水平持續(xù)上升且始終高于滅活疫苗組,其中重組病毒rAHR09-H9HA-T免疫后21 d產(chǎn)生的抗體效價最高達到24。攻毒后3、6、9天采集喉頭和泄殖腔拭子,用熒光定量PCR的方法測定其病毒含量。結(jié)果表明,重組病毒rAHR09-H9HA-O、rAHR09-H9HA-T與滅活苗均能有效降低排毒量,重組病毒rAHR09-H9HA-T組排毒量最低。綜上所述,本研究構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達外源基因的新型耐熱NDV載體rAHR09-P,并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了 3株表達H9亞型AIV HA蛋白的重組病毒,其中重組病毒rAHR09-H9HA-T在動物實驗中展現(xiàn)了良好的免疫保護效果,具有作為防控H9亞型禽流感重組活疫苗的潛力。
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65
【圖文】：

邐—，邋ｖ逡逑圖１．１邋ＮＤＶ－ｒＡＨＲ０９反向遺傳平臺構(gòu)建示意圖（引自參考文獻３３）逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋ＨＲ０９邋ｓｔｒａｉｎ邋ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ邋ｇｅｎｏｍｅ逡逑突變邋ｏｉ物邋ｆ逡逑／邋＼邋／邋＼逡逑＾邐邐邐邋、、邐Ｔｍｌ９ｎ邋＼邋ｍ邋１３３邋Ｉ邋＾逡逑．

本文編號：2717078