【摘要】：Neddylation修飾是體內(nèi)一種廣泛的翻譯后修飾作用,通過NEDD8類泛素蛋白小分子與底物蛋白的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)這種修飾作用。該修飾作用廣泛地參與細(xì)胞內(nèi)的多種調(diào)控,如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA損傷、細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等過程。最近研究發(fā)現(xiàn),流感病毒蛋白PB2能被Neddylation修飾而導(dǎo)致PB2蛋白的穩(wěn)定性降低,從而抑制了流感病毒的復(fù)制�？梢娫诹鞲胁《靖腥具^程中,體內(nèi)的Neddylation修飾起到了一種抗病毒作用。本研究通過構(gòu)建Neddylation通路關(guān)鍵酶——NEDD8活化酶(E1)的Knock down(KD)細(xì)胞系,并用流感病毒(PR8)感染,以探究流感病毒在KD細(xì)胞系中的增殖情況,為更好地闡述流感病毒與Neddylation通路之間的關(guān)系提供了依據(jù)。同時(shí)我們也制備了類泛素小分子蛋白NEDD8的單克隆抗體,這為今后更深入地研究?jī)?nèi)源性Neddylation修飾作用打下了良好的基礎(chǔ),為更好的闡述在病毒感染中Neddylation的免疫調(diào)控作用提供了實(shí)用的生物工具。本論文的主要研究結(jié)果如下:1.流感病毒在Knock down(KD)細(xì)胞系中的增殖效率升高將含有NAE1、UBA3靶序列的shRNA質(zhì)粒以及Δ8.9、VSVG輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝。將包裝出來的慢病毒感染A549細(xì)胞,感染24h或48h后在培養(yǎng)基中加入嘌呤霉素,篩選出已被慢病毒感染的細(xì)胞,經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)獲得相應(yīng)的KD細(xì)胞系,分別命名為NAE1-KD、UBA3-KD。用流感病毒(PR8,1MOI)感染獲得的KD細(xì)胞系以及對(duì)應(yīng)的對(duì)照組細(xì)胞系,感作2h后,棄上清并用無菌PBS洗去未結(jié)合的流感病毒,加入新鮮的培養(yǎng)基。在不同的時(shí)間點(diǎn)(6h、12h、24h、30h)收取細(xì)胞及細(xì)胞上清,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩個(gè)重復(fù)。通過Western blot、TCID_(50)檢測(cè)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在KD細(xì)胞系中各個(gè)時(shí)間點(diǎn),無論是病毒蛋白(NP、NS1)的表達(dá)水平,還是病毒蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄水平,或者是成熟病毒粒子滴度(TCID_(50))都較對(duì)照組細(xì)胞有明顯上升,而且在NAE1-KD細(xì)胞系中,這種上升趨勢(shì)更加明顯。因此,細(xì)胞中E1的表達(dá)水平降低之后,能夠促進(jìn)流感病毒的復(fù)制。2.類泛素小分子蛋白NEDD8單克隆抗體的制備利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)從A549細(xì)胞中擴(kuò)增出類泛素化蛋白編碼的NEDD8基因,將其克隆至原核表達(dá)載體pET-30a(+)中,測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)進(jìn)行異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo),表達(dá)獲得NEDD8蛋白,經(jīng)純化后,免疫接種6周齡BALB/c小鼠。細(xì)胞融合后,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫印跡(WB)方法篩選單克隆抗體細(xì)胞株。結(jié)果成功制備獲得3株單克隆抗體,分別命名為:4B7、1G11、1G3。免疫特異性鑒定結(jié)果表明:3株單克隆抗體都有良好的WB及ELISA效價(jià)。其中所得到的1G11株單抗適用于免疫共沉淀試驗(yàn),可以特異性檢測(cè)NEDD8修飾的Cullin-1底物。通過分段表達(dá),鑒定單抗針對(duì)的抗原表位可能在~(29)RVEE~(32)氨基酸區(qū)域,與泛素化蛋白(Ub)無交叉反應(yīng)。本研究制備的特異性單抗為進(jìn)一步鑒定NEDDylation修飾底物提供了良好的抗體工具。綜上所述,本研究初步揭示了NEDDylation修飾過程中的活化酶NAE對(duì)流感病毒增值的抑制作用,且成功制備了類泛素化蛋白NEDD8的單克隆抗體,為深入研究流感病毒分子致病的免疫調(diào)控機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.65
【圖文】：

NAE 對(duì)流感病毒增殖的影響及 NEDD8 單克隆抗體的制備圖1-1 流感病毒粒子模式圖（Gunilla B et al.2008）Figure1-1 Schematic diagram of influenza A virvs（Gunilla B et al.2008）考慮到 IAV 對(duì)人類和動(dòng)物健康的巨大威脅，通過世界組織如世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE），聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）和以“唯一健康”為宗旨的世界健康組織的全球合作對(duì)這些病毒進(jìn)行監(jiān)測(cè)和控制(Anderson, Capua et al. 2010, Pfeiffer, Otte et al. 2013,Short, Richard et al. 2015)。接種疫苗被認(rèn)為是控制和預(yù)防人和動(dòng)物的 IAV 感染的最有效途徑。但是，尤其對(duì)于工業(yè)環(huán)境中的家畜（例如，快速更新和高密度放養(yǎng)）而言，需要謹(jǐn)慎使用 IAV 疫苗，必須對(duì)疫苗的生物安全性進(jìn)行高水平的控制并對(duì)其進(jìn)行定期監(jiān)測(cè)，以防止其加速病毒進(jìn)化。盡管滅活疫苗在全世界范圍內(nèi)一直用于人類和動(dòng)物醫(yī)學(xué)，但采用最新技術(shù)的新一代 IAV 疫苗正在開發(fā)和商業(yè)化。1.1.1 人類中的季節(jié)性、大流行性和人畜共患流感病毒人類流感感染可分為季節(jié)性，大流行性和人畜共患病。季節(jié)性流感是由甲型，乙型和丙型流感病毒引起的，約占全球每年約 300 萬至 500 萬例嚴(yán)重疾病和約 25 萬至 50 萬人死亡。據(jù)估計(jì)

?流感病毒先天性免疫及 Neddylation 通路研究進(jìn)展 7圖1-2 甲型流感病毒（IAV）感染的先天性免疫應(yīng)答示意圖（Chen et al.2017）Figure1-2 Schematic diagram for innate immune response against influenza A virus(IAV) infection（Chen etal.2017）1.2.3 抗病毒分子參與先天免疫對(duì)抗 IAV 感染在 IAV 感染期間，NF-êB，IRF3 和 IRF7 特異性轉(zhuǎn)錄因子被激活而易位至細(xì)胞核，在核中啟動(dòng)編碼 IFNs 和促炎細(xì)胞因子（TNF，IL6，IL1β等）基因的轉(zhuǎn)錄。眾所周知，I 型 IFNs 如 IFN-α和 IFN-β以及 III 型 IFNs（IFN-λ1，IFN-λ2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2717080