發(fā)布時間：2020-06-12 20:25

【摘要】：自2010年鴨坦布蘇病毒病暴發(fā)以來,在我國大規(guī)模流行,給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在此情況下,迫切需要安全有效的疫苗對其流行進(jìn)行控制和預(yù)防。為此,本研究進(jìn)行了一些初步探索:1鴨坦布蘇病毒的分離與鑒定本研究對廣西某鴨場有產(chǎn)蛋下降癥狀的蛋鴨病料進(jìn)行病毒分離和鑒定。取卵巢、脾臟和肝臟勻漿后接種BHK-21細(xì)胞,盲傳3代后產(chǎn)生CPE;用雙層噬斑法對分離株進(jìn)行純化,連續(xù)3次后獲得純化的病毒。該病毒沒有血凝性,經(jīng)RT-PCR鑒定為DTMUV,命名為GX-15株。病毒在BHK-21細(xì)胞中培養(yǎng),滴度最高可達(dá)10~(7.0) TCID_(50)/0.1 mL。病毒能適應(yīng)鴨胚增殖,隨著鴨胚傳代次數(shù)增加,病毒滴度有所升高。對分離株E基因進(jìn)行測序與分析,與馬來西亞分離株MM1775同源性為89%,與國內(nèi)分離株HZ-2014同源性達(dá)96.9%;與黃病毒屬其他部分成員的同源性在53.7%-75.2%之間。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),GX-15分離株與國內(nèi)分離株HZ-2014處于一個獨立小分支,而這兩者與馬來西亞株MM1775處于同一分支。2間接ELISA方法的建立用無血清培養(yǎng)的GX-15分離株作為抗原,建立了檢測DTMUV抗體的間接ELISA方法,經(jīng)過對條件的優(yōu)化,確定了抗原包被量是5×10~(3.8)TCID_(50)/孔,血清稀釋度為1:200,羊抗鴨二抗稀釋倍數(shù)為1:4000,二抗作用45min,顯色是10min,陰陽臨界值為0.463。用該方法檢測NDV、AIV(H9)、DHAV-1、DPV、MDRV、DRV等陽性血清,結(jié)果均低于0.463,表明該方法具有良好的特異性;其敏感性可達(dá)1:1600;批內(nèi)重復(fù)試驗和批間重復(fù)試驗的變異系數(shù)均小于10%,表明該方法穩(wěn)定性很好。3櫻桃谷鴨感染模型的建立用56只60日齡無DTMUV感染的櫻桃谷鴨建立了感染模型。將它們隨機(jī)分成7組,每組8只,分別感染不同劑量的GX-15分離株,對照組注射PBS。感染后僅有10~(6.0)TCID_(50)感染劑量組和10~(5.0)TCID_(50)感染劑量組出現(xiàn)不同程度的采食下降和排深綠色稀便。病理剖檢與組織病理學(xué)觀察結(jié)果均為脾臟出現(xiàn)病變,隨著感染劑量的降低,病變逐漸減輕,直至消失。感染后第2天,10~(6.0)TCID_(50)、10~(5.0)TCID_(50)、10~(4.0)TCID_(50)、10~(3.5)TCID_(50)感染劑量組血清病毒分離率均為8/8,10~(2.5)TCID_(50)、10~(1.5)TCID_(50)感染劑量組分別為7/8和3/8;感染后第4天每組病毒分離率分別為2/8、3/8、3/8、2/8、1/8;感染后第6天和第8天各組均未分離到病毒。通過分析確定60日齡櫻桃谷肉鴨感染模型的感染劑量是10~(3.5)TCID_(50)。4 GX-15分離株免疫原性評價本研究分別對利用細(xì)胞和鴨胚培養(yǎng)的病毒,進(jìn)行滅活工藝研究。結(jié)果表明細(xì)胞毒滅活條件為:甲醛終濃度0.1%,37℃滅活20 h;鴨胚毒滅活條件為:甲醛終濃度0.1%,37℃滅活24 h。利用GX-15分離株分別制備細(xì)胞苗和鴨胚苗,評價其免疫原性。疫苗免疫核酸和抗體均為陰性的櫻桃谷鴨后14天進(jìn)行加強(qiáng)免疫,二免后第28天進(jìn)行病毒感染評價免疫攻毒保護(hù)效果。結(jié)果顯示,細(xì)胞苗和鴨胚苗均能誘導(dǎo)鴨產(chǎn)生高水平的抗體,二免后第14天趨于穩(wěn)定,第21天兩組抗體均達(dá)到最高值,兩種疫苗的免疫攻毒保護(hù)率均不低于7/10,表明分離株具有良好的免疫原性。本研究為DTMUV疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 2-1 病毒分離結(jié)果Fig.2-1 The results of virus isolationA：正常細(xì)胞；B：BHK-21 細(xì)胞病變A：BHK-21 cells; B：The CPE of BHK-21病毒的純化過三次雙層噬斑試驗得到純化的病毒。第一次純化噬斑大小不一（圖 2-5 A），從

圖 2-5 病毒噬斑純化A. 第一次雙層噬斑試驗 10-3倍稀釋孔; B. 第二次雙層噬斑試驗 10-4倍稀釋孔;C. 第三次雙層噬斑試驗 10-4倍稀釋孔; D. 對照Fig.2-5 The results of virus plaque purificationA. The 10-3dilution of the first plaque purification; B. The 10-4dilution of the second plaque purification;C. The 10-4dilution of the third plaque purification
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.32

【參考文獻(xiàn)】

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5 張s，

本文編號：2710068