【摘要】：產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium Perfringens,Cp)廣泛存在于土壤、飼料、食物及人畜腸道,但在一定條件下,可引起人和多種動(dòng)物疾病。該菌致病作用主要源于其產(chǎn)生的毒素,Cp產(chǎn)生的毒素多達(dá)16種以上,依據(jù)其產(chǎn)生的α、β、ε、ι四種毒素將該菌分為A、B、C、D、E 5個(gè)型。A型Cp(Clostridium Perfringens type A,CpA)曾被認(rèn)為是仔豬腸道微生物區(qū)系的一種正常厭氧菌,在仔豬壞死性腸炎(necrotizing enterocolitis,NEC)致病過程中的影響直到近年來才引起研究者的注意。仔豬NEC對(duì)現(xiàn)代化養(yǎng)豬業(yè)的影響在江西省乃至全國(guó)范圍內(nèi)都越來越大,且隨著抗生素在飼料中的限制使用,該病對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的影響將更為嚴(yán)重。而引起仔豬NEC的因素涉及到微生物感染、營(yíng)養(yǎng)及環(huán)境因素,非常復(fù)雜。本試驗(yàn)通過多重PCR方法從仔豬腹瀉糞樣中分離攜帶β2毒素的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌,針對(duì)分離株毒性作用建立小鼠試驗(yàn)?zāi)Ｐ?提取質(zhì)粒,對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行毒素檢測(cè)后,篩選JXJA17菌株進(jìn)行高通量測(cè)序分析;通過酵母雙雜交試驗(yàn)對(duì)β2毒素的毒性作用進(jìn)行研究。1.攜帶β2毒素的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離篩選及動(dòng)物試驗(yàn)試驗(yàn)采用改良TSC培養(yǎng)基從江西省6個(gè)地區(qū)腹瀉哺乳仔豬新鮮糞便中初分離Cp,再對(duì)所分離Cp菌株進(jìn)行生化和16SrDNA分子鑒定,通過多重PCR技術(shù)對(duì)Cp進(jìn)行基因分型,并對(duì)CpA菌株β_2毒素基因攜帶率進(jìn)行統(tǒng)計(jì),同時(shí)檢測(cè)菌株CPE毒素,然后挑選其中15株菌提取質(zhì)粒,檢測(cè)質(zhì)粒攜帶β2及CPE毒素情況。最后將CpA(β_2+/β_2-)分離株進(jìn)行小鼠毒性試驗(yàn)。結(jié)果顯示,65份哺乳仔豬糞便樣品中,Cp分離率100%,CpA分離率100%,分離得到65株CpA,其中CpA菌株的β_2毒素?cái)y帶率為98%,僅分離到一株CpA(β2-)的菌株。所分離的CpA菌株通常攜帶2~3個(gè)或3個(gè)以上質(zhì)粒,且β_2毒素基因位于CpA質(zhì)粒中,未能在質(zhì)粒中檢測(cè)到CPE毒素基因;來源于腹瀉CpA(β_2+)、CpA(β_2-)和健康樣品的CpA(β_2+)菌株(來源于實(shí)驗(yàn)室分離保存)培養(yǎng)上清腹腔接種小鼠,均可引起小鼠不同程度死亡。兔回腸結(jié)扎試驗(yàn)表明腹瀉來源的CpA(β2+/β2-)毒性作用均強(qiáng)于健康來源的CpA(β2+)。江西地區(qū)仔豬腸道CpA攜帶率及CpA(β_2+)比例均高;β2毒素毒性試驗(yàn)結(jié)果提示其毒性作用與菌株來源健康或腹瀉仔豬、是否攜帶β_2毒素關(guān)系不大,與β2毒素基因表達(dá)有關(guān),也可能與宿主腸道環(huán)境相關(guān)。2.JXJA17 CpA(β2+)江西分離株基因組從頭測(cè)序分析將試驗(yàn)一中通過分離鑒定、質(zhì)粒提取、毒素鑒定及小鼠毒性試驗(yàn)等篩選的代表菌株JXJA 17通過高通量微生物基因組從頭測(cè)序分析,結(jié)果顯示JXJA 17基因組全長(zhǎng)3,324,072bp,包含9個(gè)完整質(zhì)粒,共編碼3396個(gè)基因。其中基因組編碼3092個(gè)DNA序列,30個(gè)rRNA基因(10 5S,10 16S和10 23S),95個(gè)tRNA基因和0個(gè)非編碼RNA。9個(gè)質(zhì)粒大小分別為:58,796、38,284、62,027、40,125、36,275、12,326、12,133、3,550和11,801bp。毒素?cái)?shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比顯示僅含有α毒素與β2毒素,耐藥基因高達(dá)20余種,通過基因組圈圖繪制、eggNOG功能注釋、KEGG功能注釋、CRISPR等預(yù)測(cè)對(duì)JXJA17致病株進(jìn)行分析,有助于了解該細(xì)菌在本地區(qū)流行病學(xué)變遷及進(jìn)化特點(diǎn)。本試驗(yàn)對(duì)JXJA17致病株進(jìn)行全基因測(cè)序,了解本地區(qū)CpA基因組特點(diǎn),特別是本地區(qū)攜帶率較高的β2毒素基因的特點(diǎn),為研究CpAβ2毒素的毒性作用提供前期研究基礎(chǔ),也為研究我國(guó)仔豬梭菌性腸炎分子流行病學(xué)特點(diǎn)提供基因參考。3.β2毒素酵母雙雜交試驗(yàn)為進(jìn)一步研究β2毒素毒性作用,采用豬腸上皮細(xì)胞建立文庫(kù),研究β2毒素與豬腸上皮細(xì)胞蛋白之間的相互作用,根據(jù)JXJA17測(cè)序結(jié)果擴(kuò)增β2毒素基因,進(jìn)行酵母雙雜交試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明β2毒素轉(zhuǎn)入酵母體內(nèi),對(duì)酵母生長(zhǎng)不產(chǎn)生抑制作用,pGBKT7-β2毒素融合蛋白成功在酵母體內(nèi)表達(dá),豬小腸細(xì)胞系IPEC-1存在與β2毒素相互作用的蛋白,而相互作用蛋白的作用機(jī)制還需要更進(jìn)一步的深入研究。本試驗(yàn)采用的β2毒素酵母雙雜交試驗(yàn)為進(jìn)一步研究β2毒素毒性作用提供試驗(yàn)參考。
【圖文】：

4圖1CpA 質(zhì)粒毒素?cái)y帶情況Fig 1 Description of CpA plasmid toxin4.3 β2 毒素生物學(xué)特性編碼 β 和 β2 毒素的基因已被報(bào)道位于 Cp 菌的非連接大質(zhì)粒上，β2 毒素與 β 毒素具有相似的生物學(xué)活性，均是具有細(xì)胞毒性與致死性的強(qiáng)毒素。Gilbert[9]等報(bào)道靜脈注射 3μg 純化的 β2 毒素對(duì)小鼠具有致死性。β2 毒素在體外具有活性，對(duì)小腸黏膜上皮細(xì)胞（I407，現(xiàn)被美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏列為 HeLa 細(xì)胞）與中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞具有強(qiáng)細(xì)胞毒性,導(dǎo)致細(xì)胞變圓和死亡[9]。然而，細(xì)胞毒性劑量并非絕對(duì)的，而是介于0.2～20ug/ml 濃度范圍內(nèi)，并且毒素不穩(wěn)定時(shí)更易喪失毒性。目前還不知道β2 毒素是如何引起細(xì)胞死亡的，但已提出可能與β毒素作用機(jī)制相似，在細(xì)胞膜上形成孔隙或?qū)е录?xì)胞膜破壞

注射同等劑量生理鹽水，觀察 48h 小鼠死亡情況；（4）重復(fù)（3）試驗(yàn)，，每組小鼠增加至 10 只。1.6 攜帶β2 毒素 CpA 兔回腸結(jié)扎試驗(yàn)選取試驗(yàn)菌株 5 株：CpA（CVCC2020，β2-）、CpC（CVCC2041）、CpA（腹瀉分離株β2-）、JXJA17（腹瀉樣分離株β2+）、3B（健康樣分離株β2+）、空白組（肉肝胃酶培養(yǎng)基），將選取菌株接至 FTG 液體培養(yǎng)基內(nèi) 37℃擴(kuò)增 18h 后，接至肉肝胃酶消化培養(yǎng)湯中培養(yǎng) 8h，收集菌液注射準(zhǔn)備。兔子保定后，實(shí)施麻醉，剖開腹腔，找到回腸結(jié)扎，注射菌樣 1ml，兔子體內(nèi)保存 6h 后，觀察病變。2 結(jié)果2.1 細(xì)菌分離、生化鑒定及 16SrDNA 鑒定結(jié)果所分離得到的菌株在 0.04%D-環(huán)絲氨酸 FTG 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，培養(yǎng)基變渾濁，并有氣泡產(chǎn)生。接種于血平板培養(yǎng)后，形成圓形、邊緣整齊、灰白色、表明光滑半透明、圓屋頂狀的菌落；菌落周圍有雙層溶血圈，細(xì)菌純化后經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，可見兩端鈍圓的革蘭陽性直桿狀菌，多為單個(gè)散在或成對(duì)排列，無鞭毛。如圖 2-1 所示。
【學(xué)位授予單位】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2709699