【摘要】：雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum,MG)感染主要引起雞慢性呼吸道疾病(CRD)。雞慢性呼吸道疾病是以呼吸Up音、咳嗽及流鼻涕等為主要臨床特征的高度接觸性傳染病,給家禽養(yǎng)殖行業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。雞毒支原體感染的發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明,探究其發(fā)病機(jī)制尤為重要。研究證實(shí)micro RNAs在許多疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本研究在前期高通量測(cè)序的基礎(chǔ)上,以gga-mi R-16-5p為研究對(duì)象,探究其在MG感染中的作用及調(diào)控機(jī)制。試驗(yàn)通過(guò)Real-time Quantitative PCR(q PCR)檢測(cè)了雞胚及DF-1細(xì)胞中g(shù)ga-mi R-16-5p的相對(duì)表達(dá)量,以確證高通量測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)gga-mi R-16-5p在雞胚感染MG-HS后第6d、7d、8d肺組織及感染MG-HS的DF-1細(xì)胞中的表達(dá)量顯著或極顯著高于正常組(p0.05或p0.01)。使用靶基因預(yù)測(cè)軟件Target Scan和mi RDB預(yù)測(cè)gga-mi R-16-5p的靶基因,選取軟件預(yù)測(cè)交集并結(jié)合炎癥通路進(jìn)行篩選,初步確定PIK3R1作為gga-mi R-16-5p的候選靶基因。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn),gga-mi R-16-5p能夠與PIK3R1 3’UTR的種子序列結(jié)合,能顯著抑制PIK3R1 3’UTR區(qū)域的報(bào)告基因活性。進(jìn)一步通過(guò)q PCR及Western blot分析發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后,gga-mi R-16-5p超表達(dá)能顯著抑制PIK3R1 m RNA及蛋白的表達(dá),同時(shí)顯著抑制PI3K/AKT通路下游蛋白P-AKT的表達(dá)量,然而抑制gga-mi R-16-5p后的結(jié)果與超表達(dá)正好相反。通過(guò)q PCR檢測(cè)靶基因PIK3R1在DF-1細(xì)胞及雞胚肺組織中的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果表明,雞胚感染MG-HS后第7d、8d肺組織及MG-HS感染的DF-1細(xì)胞中PIK3R1的表達(dá)量顯著或極顯著低于正常組(p0.05或p0.01)。通過(guò)CCK-8及流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)了gga-mi R-16-5p對(duì)DF-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響,發(fā)現(xiàn)MG能顯著抑制DF-1細(xì)胞的增殖,使大量的細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期的G1期;DF-1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)gga-mi R-16-5p后,在48h和72h,過(guò)表達(dá)gga-mi R-16-5p能顯著降低DF-1細(xì)胞的增殖速率(p0.01),由G1期進(jìn)入G2期的細(xì)胞大量減少;而抑制gga-mi R-16-5p后72h,DF-1細(xì)胞增殖顯著增加(p0.01),大量的細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的G2+S期。過(guò)表達(dá)gga-mi R-16-5p能使細(xì)胞大量凋亡,抑制gga-mi R-16-5p后細(xì)胞凋亡減少。過(guò)表達(dá)gga-mi R-16-5p后,NF-κB以及下游的TNF-α表達(dá)量顯著下降(p0.05)。本研究確證了雞胚及細(xì)胞感染MG-HS后,gga-mi R-16-5p的表達(dá)量顯著上調(diào),通過(guò)降低靶基因PIK3R1的表達(dá)而抑制PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路的活性,通過(guò)抑制細(xì)胞周期進(jìn)程,促進(jìn)細(xì)胞凋亡而阻滯細(xì)胞的增殖,使大量細(xì)胞停留在G1期。
【圖文】：

圖 3-1 PCR 擴(kuò)增檢測(cè)內(nèi)參基因 5S-rRNAarker I，1-10 泳道為肺組織樣的 cDNA，11 泳道為陰Fig.3-1 Detect the quality of cDNA using 5Sarker I, Lane1-10: cDNA of lung tissue; Lane11: negative6-5p 的擴(kuò)增及檢測(cè)糖凝膠電泳檢測(cè)肺組織 cDNA，各樣本在 80 b相符，，初步推測(cè)已獲得 gga-miR-16-5p 基因（8圖 3-2 PCR 擴(kuò)增檢測(cè)肺組織中 gga-miR-16-5p

圖 3-1 PCR 擴(kuò)增檢測(cè)內(nèi)參基因 5S-rRNArker I，1-10 泳道為肺組織樣的 cDNA，11 泳道為陰Fig.3-1 Detect the quality of cDNA using 5Sker I, Lane1-10: cDNA of lung tissue; Lane11: negativ-5p 的擴(kuò)增及檢測(cè)糖凝膠電泳檢測(cè)肺組織 cDNA，各樣本在 80符，初步推測(cè)已獲得 gga-miR-16-5p 基因（
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S858.31

【參考文獻(xiàn)】

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1 王方平;張平安;牛志立;;miRNA-122與丙肝病毒感染及肝癌關(guān)系的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2016年05期

2 尹志華;郭粉蓮;曾惠瓊;曹智君;羅秀霞;葉志中;孫華麟;;miRNA-16在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血中的表達(dá)及作用[J];中國(guó)綜合臨床;2015年02期

3 馬麗;楊丕山;王燕;;人牙根尖乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)及TNF-α對(duì)其增殖的影響[J];上�？谇会t(yī)學(xué);2010年05期

4 薛茜;楊安鋼;;miRNA在免疫系統(tǒng)中的研究進(jìn)展[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2010年01期

5 楊彬;程石;閆文貌;宋茂民;;NF-κB活化在氯化釓誘導(dǎo)ANP肺泡巨噬細(xì)胞凋亡中的作用[J];中國(guó)普通外科雜志;2009年09期

6 楊季云;張思仲;郭紅;曾祥元;馬布仁;;腫瘤壞死因子α通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路加快肝細(xì)胞周期進(jìn)程[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2007年06期

7 李春陽(yáng);李林;李宇航;艾厚喜;張麗;;環(huán)烯醚萜苷對(duì)大鼠腦梗死后NF-κB與凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2/Bax表達(dá)變化的影響[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2006年01期

8 黃宇戈,譚建新,黃迪南,徐美奕,鄭朝暉,黃秀蘭;腺苷抑制NF-κB在肺炎大鼠心肌損傷中的作用[J];心臟雜志;2004年04期

9 張守明,戚鳳霞,宋林合;雞敗血霉形體病的病因分析與綜合防制[J];中國(guó)家禽;2000年02期

10 張海燕,馬鴻儒,潘李珍;TNF-α對(duì)人肺癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制作用和對(duì)細(xì)胞周期的影響[J];中國(guó)腫瘤生物治療雜志;1998年04期

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3 張曉戰(zhàn);哺乳動(dòng)物源呼腸孤病毒激活PI3K/Akt通路調(diào)控宿主抗病毒免疫應(yīng)答的分子機(jī)制[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

4 侯春英;MET-PI3K-Akt信號(hào)通路介導(dǎo)miRNA-31調(diào)控肺腺癌腫瘤干細(xì)胞功能[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2016年

5 林友成;PIK3R1基因在腎細(xì)胞癌中的功能及調(diào)控機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

6 馬春燕;miRNA-124在肺泡上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌感染中的免疫調(diào)控機(jī)制研究[D];寧夏大學(xué);2014年

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3 王在瑋;miR-99a與miR-146c在雞毒支原體感染中的作用研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 張少波;病毒傳染性疾病中miRNA的調(diào)控功能及診斷效能的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

5 胡慶昌;miR-19在雞毒支原體感染中的作用研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

6 薛文仲;甲型H1N1流感病毒介導(dǎo)小鼠肺炎的相關(guān)miRNA的篩選與功能分析[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2012年

7 宋星宇;TNF-α在肺炎支原體肺炎模型中的表達(dá)及機(jī)制的研究[D];吉林大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2709510