【摘要】：犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起的一種急性傳染病,以出血性腸炎與心肌炎為主要臨床特征,此病發(fā)病率、死亡率均較高,常呈大范圍爆發(fā)性流行。本病的治療主要通過(guò)給患犬注射CPV高免血清。當(dāng)前貴陽(yáng)市主要流行的CPV毒株為CPV-2a亞型,當(dāng)前臨床上所用的抗CPV血清主要由CPV-2亞型毒株研制,雖在一定程度上提高了對(duì)犬細(xì)小病毒病的治愈率,但治療失敗的現(xiàn)象也很普遍。為了探索本研究中的血清對(duì)目前貴陽(yáng)市犬細(xì)小病毒病的治療效果開展本實(shí)驗(yàn),為以后犬細(xì)小病毒病的治療提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。1.犬細(xì)小病毒2a亞型VP2蛋白的原核表達(dá)與純化以實(shí)驗(yàn)室保存的CPV-2a亞型VP2基因重組克隆質(zhì)粒為模板,通過(guò)雙酶切將其定向插入到原核表達(dá)載體p ET-32a(+)構(gòu)建重組原核表達(dá)載體構(gòu)建p ET-32a-VP2。將p ET-32a-VP2轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),摸索最佳IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度等表達(dá)條件,通過(guò)SDS-PAGE電泳檢查結(jié)果。結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)的重組菌株可表達(dá)出大小為64 ku的His-VP2重組蛋白;1 m M IPTG、37℃、誘導(dǎo)5 h為其最佳表達(dá)條件;重組蛋白主要以包涵體的形式存在。將表達(dá)的His-VP2重組蛋白用親和層析鎳柱掛柱,以不同濃度(50 mmol/L、400 mmol/L)咪唑進(jìn)行洗脫,進(jìn)行蛋白純化。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明,純化的重組蛋白在64 ku大小處出現(xiàn)無(wú)雜帶的目的條帶;經(jīng)Western Blottting檢測(cè),在64 ku處出現(xiàn)單一的目的條帶。2.抗犬細(xì)小病毒2a亞型VP2蛋白免疫血清的制備將純化的His-VP2重組蛋白經(jīng)過(guò)透析復(fù)性,BCA法測(cè)定濃度后與弗氏佐劑等體積乳化制備亞單位疫苗(BCA法測(cè)出蛋白濃度約為500μg/m L),采用皮下多點(diǎn)注射的方式免疫5只健康犬,共免疫3次,每次免疫劑量為1 m L(蛋白含量約為250μg),并于每次免疫后13 d抽取犬全血進(jìn)行ELISA抗體濃度、特異性Western Blottting鑒定。ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果顯示:免疫犬1、2、3、5在二免后13天抗體水平均相對(duì)最高,免疫犬4在三免后13天抗體水平均相對(duì)最高,5只犬均在抗體最高時(shí)進(jìn)行免疫血清的大量制備;血清作為一抗經(jīng)Western Blottting檢測(cè)VP2蛋白約在64 ku處出現(xiàn)單一的目的條帶,說(shuō)明血清具有良好的特異性。3.免疫血清療效研究將臨床上采集的犬細(xì)小病毒經(jīng)離心濾菌后同步接種于貓腎細(xì)胞并盲傳三代,待細(xì)胞病變(CPE)達(dá)90%后收毒,經(jīng)過(guò)HA、PCR方法進(jìn)行鑒定;采用Reed-Muench法測(cè)定病毒TCID50。結(jié)果表明CPV的血凝效價(jià)為29、TCID50為107.42/100μL、PCR成功擴(kuò)增出CPV NS1基因,大小為2 007 bp。按1 m L/kg的毒量以口服方式對(duì)健康犬進(jìn)行人工感染CPV實(shí)驗(yàn),在犬發(fā)病后,用制備的免疫血清對(duì)犬進(jìn)行治療,同時(shí)設(shè)立商品化血清作為對(duì)照,用量均為1 m L/kg,統(tǒng)計(jì)治愈率。結(jié)果顯示犬攻毒后均發(fā)生嘔吐、拉稀等臨床癥狀;自制血清治療組的3只治療犬中死亡了1只,治愈了2只;商品化血清治療組的3只治療犬中死亡2只,治愈1只,相比之下自制血清較商品化血清對(duì)CPV患犬的治愈率較高。
【圖文】：

重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化濃度的優(yōu)化為 0.2、0.5、1、1.5、2.0 mmol/L 的 IPTGE 電泳，結(jié)果顯示終濃度為 1 mM IPTG 濃度誘導(dǎo)的表達(dá)量，，蛋白濃度高（如圖M 1 2 3 4565500圖 1.1 重組質(zhì)粒 pET-VP2 雙酶切combinant plasmid pET-VP2 digested with BamHM DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL5 000; 1~2：重組質(zhì)粒 pET-VP marker DL5 000; 1~2：Recombinant plasmid p

2 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化導(dǎo)濃度的優(yōu)化為 0.2、0.5、1、1.5、2.0 mmol/L 的 IPTG 進(jìn)GE 電泳，結(jié)果顯示終濃度為 1 mM IPTG 誘G 濃度誘導(dǎo)的表達(dá)量，蛋白濃度高（如圖 1M 1 2 3 456180 ku130 ku5圖 1.1 重組質(zhì)粒 pET-VP2 雙酶切ecombinant plasmid pET-VP2 digested with BamH IM DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL5 000; 1~2：重組質(zhì)粒 pET-VP2NA marker DL5 000; 1~2：Recombinant plasmid pET
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S858.292

【參考文獻(xiàn)】

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1 林鵬;趙航;王建科;程悅寧;任靜強(qiáng);易立;仝明薇;程世鵬;;犬細(xì)小病毒的分離鑒定及其VP2基因序列分析[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2015年10期

2 縣曉軍;;犬細(xì)小病毒病的診斷技術(shù)[J];農(nóng)民致富之友;2015年18期

3 買買提·黑牙斯丁;瑪依努爾;;犬細(xì)小病毒的病的診斷與治療[J];南方農(nóng)業(yè);2015年21期

4 毛倩倩;卜賓;唐青海;闞云超;姚倫廣;唐存多;焦鑄錦;楊建偉;;犬細(xì)小病毒NY株VP2蛋白的原核表達(dá)及反應(yīng)原性鑒定[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2015年06期

5 劉潔;牟林琳;何文輝;李晶梅;謝紅玲;廖園園;朱薇;漆世華;溫文生;;犬細(xì)小病毒膠體金檢測(cè)試紙條的制備與初步評(píng)價(jià)[J];中國(guó)獸藥雜志;2014年03期

6 許冬蕾;任常寶;張曉戰(zhàn);陳葉;余文蘭;葛曾旭;陳瑞愛(ài);唐兆新;;廣州地區(qū)犬細(xì)小病毒VP2基因的序列分析[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2013年12期

7 劉靜;趙學(xué)剛;陸江;鄭曉亮;袁維峰;;犬細(xì)小病毒病流行病學(xué)調(diào)查[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2013年03期

8 賀英;潘素敏;楊彩然;張艷英;史秋梅;邵新華;;犬細(xì)小病毒(CPV-2)的分子生物學(xué)特性與進(jìn)化[J];河北科技師范學(xué)院學(xué)報(bào);2013年01期

9 艾靜;袁玉國(guó);彭秋玲;艾妮絲;;犬細(xì)小病毒病的流行病學(xué)調(diào)查[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2012年11期

10 褚秀玲;段玉梅;曲緒友;李俊霞;蘇建青;;犬細(xì)小病毒的分離與鑒定[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年20期

本文編號(hào)：2708990