【摘要】：牛肉肌內(nèi)脂肪(Intramuscular fat,IMF)呈白色大理石紋(Marbling)狀分布,俗稱為大理石花紋,是牛肉等級評定的重要指標(biāo)之一,大理石花紋越豐富,表明牛肉的肌內(nèi)脂肪含量越高,牛肉品質(zhì)也更優(yōu)異。肌內(nèi)脂肪的沉積受遺傳、基因以及表觀遺傳學(xué)的調(diào)控,其中MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼RNA,由19~22個核苷酸構(gòu)成,在哺乳動物前體脂肪細(xì)胞的分化中發(fā)揮著重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。此前研究發(fā)現(xiàn)bta-miR-130a能夠通過調(diào)控PPARG來調(diào)節(jié)乳脂的合成,然而目前對bta-miR-130調(diào)節(jié)前體脂肪細(xì)胞分化的作用及機制尚不清楚。基于以上研究背景,本研究以秦川牛前體脂肪細(xì)胞為研究對象,系統(tǒng)探討了bta-miR-130a/b在牛前體脂肪細(xì)胞分化過程中的作用及分子機制。本研究中首先分離獲得秦川牛前體脂肪細(xì)胞,通過轉(zhuǎn)染bta-miR-130a/b模擬物(mimics)和抑制物(inhibitor)于秦川牛前體脂肪細(xì)胞,探究了在過表達(dá)和抑制情況下bta-miR-130a/b在前體脂肪細(xì)胞分化過程中的作用;并運用生物信息學(xué)方法預(yù)測bta-miR-130a/b與脂肪分化相關(guān)的靶基因,后續(xù)通過雙熒光素酶活性檢測以及體外挽救試驗,鑒定了bta-miR-130a/b的直接靶基因,獲得的試驗結(jié)果如下:1.Bta-miR-130a/b抑制秦川牛前體脂肪細(xì)胞的分化過表達(dá)bta-miR-130a/b并進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化,細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的含量以及脂滴的數(shù)量顯著降低;相反,當(dāng)抑制bta-miR-130a/b的表達(dá)時,細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的含量和脂滴的數(shù)量明顯增多。2.Bta-miR-130a/b調(diào)控脂肪分化相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)脂肪細(xì)胞中bta-miR-130a/b表達(dá)量升高會抑制脂肪細(xì)胞中C/EBPα、C/EBPβ、FABP4、LPIN1和LPL等成脂相關(guān)基因的表達(dá);而降低bta-miR-130a/b的表達(dá)量時,C/EBPα、C/EBPβ、FABP4、LPIN1和LPL等基因表達(dá)量升高。3.Bta-miR-130a/b直接靶向負(fù)調(diào)控PPARG在mRNA以及蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn),bta-miR-130a/b的含量提高時,PPARG的表達(dá)量顯著降低,反之bta-miR-130a/b降低時,PPARG的表達(dá)量升高;雙熒光素酶報告載體活性研究發(fā)現(xiàn),bta-miR-130a/b mimics能顯著抑制PPARG野生型熒光素酶報告載體的活性;體外挽救試驗結(jié)果顯示,在前體脂肪細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染PPARG-siRNA和bta-miR-130a/b inhibitor并進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化后,與單獨轉(zhuǎn)染bta-miR-130a/b inhibitor處理組相比,成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴含量明顯減少。因此bta-miR-130a/b可通過直接靶向PPARG進(jìn)行負(fù)調(diào)控從而影響前體脂肪細(xì)胞分化。4.Bta-miR-130a/b直接靶向正調(diào)控CYP2U1在mRNA以及蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn),bta-miR-130a/b的含量提高時,CYP2U1的表達(dá)量顯著提高,反之bta-miR-130a/b降低時,CYP2U1的表達(dá)量降低;雙熒光素酶報告載體活性研究發(fā)現(xiàn),bta-miR-130a/b mimics能顯著抑制CYP2U1野生型熒光素酶報告載體的活性;體外挽救試驗結(jié)果顯示,在前體脂肪細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染CYP2U1-siRNA和bta-miR-130a/b inhibitor時,與單獨轉(zhuǎn)染bta-miR-130a/b inhibitor處理組相比,細(xì)胞內(nèi)脂滴含量明顯增加。因此bta-miR-130a/b可通過直接靶向CYP2U1進(jìn)行正調(diào)控從而影響前體脂肪細(xì)胞分化。本研究揭示,bta-miR-130a/b對脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)合成是必不可少的,可通過直接靶向PPARG和CYP2U1來調(diào)控前體脂肪細(xì)胞分化。該研究結(jié)果為研究非編碼RNA調(diào)控脂肪發(fā)育進(jìn)而改善牛肉品質(zhì)提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S823

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本文編號：2708504