【摘要】：miRNAs是近來發(fā)現(xiàn)重要的表觀遺傳因子,其在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達起重要調(diào)控作用,并廣泛參與機體的各個生命過程。胚胎期的肌肉發(fā)育決定了肌纖維的總數(shù),對畜禽肌肉產(chǎn)量、生長速度及成年體重等具有至關重要的影響。為探究miRNA對胚胎期骨骼肌發(fā)育的調(diào)控作用及其分子機制,并為肌肉發(fā)育調(diào)控尋找新的靶點,以課題組前期通過高通量測序技術篩選到的雞成肌細胞由增殖到分化各不同時期差異表達的關鍵miRNAs及預測的與其表達成負相關的靶基因(P0.01)信息為基礎,本試驗以其中顯著上調(diào)關鍵miRNA gga-miR-206(P0.01)作為研究的切入點,并結(jié)合其他數(shù)據(jù)庫共同預測結(jié)果選取其中顯著下調(diào)的遠端上游元件結(jié)合蛋白1(FUBP1)、胸腺素β4(TMSB4X)及酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-單加氧酶活化蛋白β(YWHAB)(P0.01)作為候選靶基因。分別通過實時熒光定量、雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)以三次獨立并至少兩次重復試驗,對miRNA及各候選靶基因的表達量以及靶關系進行了探究和鑒定。主要結(jié)果如下:1、gga-miR-206及候選靶基因發(fā)育表達譜及相關關系分析。運用實時熒光定量PCR的方法,分析了 gga-miR-206與候選靶基因在胚胎發(fā)育各不同時期骨骼肌中的相對表達量并通過軟件對其之間相關性進行分析。結(jié)果表明,gga-miR-206在腿肌中的表達整體呈先上升后下降的趨勢,且在16胚齡(E16)達到高峰(P0.05),在胚胎發(fā)育后期至出生后又有所回升;而在胸肌中表達整體呈現(xiàn)下降趨勢,10胚齡(E10)時表達量最高(P0.05),在16胚齡(E16)出現(xiàn)一個小高峰。相關性分析結(jié)果顯示,在雞胚骨骼肌發(fā)育過程中,YWHAB的表達與gga-miR-206呈負相關(P0.05);其次,TMSB4X與gga-miR-206的表達呈負相關(P0.05);與之相反,FUBP1的表達與gga-miR-206之間呈正相關(P0.05)。2、候選靶基因組織表達譜構建。運用qRT-PCR技術分別檢測了三個候選靶基因在300日齡金茅黑雞A系母本8個組織中的相對表達情況,對各基因功能進行初步定位判斷,結(jié)果顯示:FUBP1富集于肝臟和腿肌組織,極顯著高于其余組織中的表達量(P0.01);相對于此,FUBP1在心肌中則表達較少,而在胸肌和卵巢組織中則幾乎不表達;對于YWHAB則高表達于骨骼肌組織(P0.01),在心肌中也有少量表達,而在脾和卵巢組織中表達最低;TMSB4X在各組織中均有不同程度表達,在心肌和胸肌中相對高表達,其次為腿肌、肝、脾、肺等組織,而在腎和卵巢組織中表達量最少,與其余組織間差異顯著或極顯著(P0.05 orP0.01)。3、gga-miR-206與YWHAB/FUBP1靶關系驗證。結(jié)合前述研究內(nèi)容,對gga-miR-206與YWHAB/FUBP1之間的靶關系進行了鑒定。分別構建YWHAB/FUBP13'UTR野生型和突變型pmirGLO表達載體,并與miR-206模擬物、陰性對照分別共轉(zhuǎn)染人胚腎293T細胞,以轉(zhuǎn)染空載組作為空白對照。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,共轉(zhuǎn)染YWHAB野生型載體與miR-206 mimics組顯著降低螢火蟲熒光素酶的相對活性(P0.05),但其余各組試驗組與對照組之間均無顯著差異(P0.05)。結(jié)果提示YWHAB與gga-miR-206存在靶關系,該基因mRNA3'UTR 1429-1435核苷酸序列為關鍵作用靶點;FUBP1則不是gga-miR-206的靶基因。
【圖文】：

Ｍｌ邋２邋３邐４邋５邋６邋７邐８邋９邋１０邋１１邋１２逡逑■Ｈ逡逑９９９ｃ／９９９邋ｃｆｄ－９ｃｆ９逡逑圖２．１雞胚的性別鑒定結(jié)果逡逑６．邋２組織ＲＮＡ完整性檢測結(jié)果逡逑對提取的雞各胚齡骨骼肌組織總ＲＮＡ進行檢測，１％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖２．２）顯逡逑示總ＲＮＡ的２８Ｓ和１８Ｓ條帶清晰，５Ｓ幾乎沒有，２８Ｓ條帶與１８Ｓ條帶的比值＞１．５；逡逑ＯＤ２６０／ＯＤ２８０介于１．８？２＿０之間。表明ＲＮＡ完整性好，無ＤＮＡ、蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)污染，逡逑可用于后續(xù)實驗。逡逑＾２８Ｓ逡逑－ｌＯＯ逡逑ｍｎｎ＾ｉ－ｓｓ逡逑圖２．邋２邋ＲＮＡ完整性檢測逡逑（Ｍ：邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１、２、３、４邋為各樣品號）逡逑６．邋３邋ｍｉ邋ＲＮＡ定量分析逡逑ＡＢＩ邋７５００熒光定量ＰＣＲ結(jié)果顯示（圖２．３－圖２．４），擴增曲線重疊性好，熔解曲線顯逡逑示為平滑的單峰，在Ｔｍ兩邊均無雜峰。表明所設計引物特異性良好，，無引物二聚體和非逡逑特異性擴增。逡逑

圖２．１雞胚的性別鑒定結(jié)果逡逑６．邋２組織ＲＮＡ完整性檢測結(jié)果逡逑對提取的雞各胚齡骨骼肌組織總ＲＮＡ進行檢測，１％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖２．２）顯逡逑示總ＲＮＡ的２８Ｓ和１８Ｓ條帶清晰，５Ｓ幾乎沒有，２８Ｓ條帶與１８Ｓ條帶的比值＞１．５；逡逑ＯＤ２６０／ＯＤ２８０介于１．８？２＿０之間。表明ＲＮＡ完整性好，無ＤＮＡ、蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)污染，逡逑可用于后續(xù)實驗。逡逑＾２８Ｓ逡逑－ｌＯＯ逡逑ｍｎｎ＾ｉ－ｓｓ逡逑圖２．邋２邋ＲＮＡ完整性檢測逡逑（Ｍ：邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１、２、３、４邋為各樣品號）逡逑６．邋３邋ｍｉ邋ＲＮＡ定量分析逡逑ＡＢＩ邋７５００熒光定量ＰＣＲ結(jié)果顯示（圖２．３－圖２．４），擴增曲線重疊性好，熔解曲線顯逡逑示為平滑的單峰，在Ｔｍ兩邊均無雜峰。表明所設計引物特異性良好，無引物二聚體和非逡逑特異性擴增。逡逑
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S831

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本文編號：2708461