【摘要】：裂谷熱(Rift Valley Fever,RVF)是由裂谷熱病毒(Rift Valley Fever virus,RVFV)引起的急性、烈性人獸共患傳染病。RVFV可經(jīng)蚊蟲(chóng)叮咬、直接接觸和氣溶膠傳播,主要感染綿羊、山羊和牛等反芻動(dòng)物,可引起懷孕母畜的病死率高達(dá)80%~100%,成年反芻動(dòng)物的病死率達(dá)20%,未出生的和幼齡動(dòng)物病死率近100%,同時(shí)也能感染人引起發(fā)病。該病自1931年在肯尼亞大規(guī)模暴發(fā)后,多次在非洲東部、南部及阿拉伯半島流行,給社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全。因此,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties,OIE)將RVF列為法定呈報(bào)傳染病,我國(guó)農(nóng)業(yè)部將其列為一類(lèi)傳染病。目前,國(guó)內(nèi)外尚無(wú)獲批的商品化人用RVF疫苗及有效治療藥物。當(dāng)前,隨著全球化經(jīng)濟(jì)貿(mào)易的快速發(fā)展,各國(guó)對(duì)動(dòng)物制品貿(mào)易的進(jìn)出口日益頻繁,加之中國(guó)在地理位置上緊鄰阿拉伯半島,外來(lái)人獸共患病自然感染或輸入性病例的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加。2016年7月,我國(guó)北京確診的首例輸入性裂谷熱病例為我們敲響了警鐘。因此建立快速、敏感、特異的RVF診斷方法,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)疫病的發(fā)生和流行的及早防控具有重要意義。RVFV為單股負(fù)鏈RNA病毒,屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)白蛉病毒屬(Phlebovirus),僅有一個(gè)血清型。RVFV基因組由S、M、L 3個(gè)節(jié)段組成,其中S節(jié)段長(zhǎng)1690 nt,采用雙向編碼策略,正義鏈編碼一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(Non-structural protein,NSs),反義鏈編碼核衣殼蛋白(Nucleoprotein,NP);M節(jié)段長(zhǎng)3885 nt,編碼四個(gè)蛋白,兩個(gè)囊膜糖蛋白Gn和Gc,兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NSm1和NSm2;L節(jié)段長(zhǎng)6404 nt,編碼RNA依賴(lài)的RNA聚合酶。本研究旨在建立RVFV核酸和抗體快速檢測(cè)方法,為RVF的快速診斷、監(jiān)測(cè)預(yù)警與流行病學(xué)調(diào)查等提供簡(jiǎn)單、快速、敏感的檢測(cè)技術(shù)和方法。1.RVFV反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增核酸可視化檢測(cè)方法的建立與評(píng)價(jià)本研究針對(duì)不同分離年代、不同種屬、不同地域來(lái)源的共25條RVFV S基因進(jìn)行序列分析,通過(guò)MEGA 7軟件分析篩選序列的高度保守區(qū),針對(duì)保守區(qū)設(shè)計(jì)6條特異性引物,用于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。通過(guò)優(yōu)化擴(kuò)增時(shí)間、溫度、引物濃度來(lái)提高擴(kuò)增效率,建立RVFV反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增核酸可視化(Reverse Transcription Loop-mediated isothermal amplification nucleic acid visualization,RT-LAMP-VF)檢測(cè)方法,并進(jìn)行特異性評(píng)價(jià)、敏感性評(píng)價(jià)、與Real-time RT-PCR方法的對(duì)比評(píng)價(jià)以及模擬臨床樣本初步評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示:以人工合成的RNA為模板,成功建立了RVFV RT-LAMP-VF檢測(cè)方法,在63℃反應(yīng)20 min即可檢測(cè)到1.94×10~5 copies/μL的病毒RNA,反應(yīng)60 min,檢測(cè)限可達(dá)1.94×10~0 copies/μL的RNA。以RVFV-BJ01株滅活病毒提取的RNA為模板,可檢測(cè)到1.83×10~3 copies/μL的病毒RNA。此外,該方法對(duì)模擬臨床樣本檢測(cè)的結(jié)果為陽(yáng)性。綜上,RVFV RT-LAMP-VF方法通過(guò)使用一次性核酸可視化檢測(cè)裝置觀察擴(kuò)增結(jié)果,實(shí)現(xiàn)了肉眼可見(jiàn)、結(jié)果更直觀的讀取同時(shí)避免了常規(guī)等溫?cái)U(kuò)增中的氣溶膠污染問(wèn)題,結(jié)果精準(zhǔn)、敏感性強(qiáng)、特異性高、無(wú)需昂貴儀器設(shè)備,適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。2.RVFV間接血凝抗體檢測(cè)方法的建立與評(píng)價(jià)本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增RVFV Gn蛋白胞外區(qū)(ectodomain,eGn)基因,連入原核表達(dá)載體pET-30a(+),構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a(+)-RVFV-eGn,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21/DE3感受態(tài),IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),經(jīng)脲素復(fù)性后再經(jīng)His標(biāo)簽蛋白純化柱純化目的蛋白。將純化的目的蛋白作為抗原,致敏醛化后的綿羊紅細(xì)胞。通過(guò)優(yōu)化致敏時(shí)間、抗原量、反應(yīng)溫度建立RVFV間接血凝抗體檢測(cè)方法,進(jìn)行重復(fù)性、RVFV血清樣品檢測(cè),特異性評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示:PCR特異性擴(kuò)增出1287 bp的目的片段,并成功構(gòu)建出重組質(zhì)粒DE3-pET30a(+)-RVFV-eGn。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞后可有效表達(dá)目的蛋白,確定最佳表達(dá)條件為30℃,0.8mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h,目的蛋白以包涵體形式表達(dá)。純化后目的蛋白純度為94.136%,以其作為抗原,確定最佳致敏條件為37℃,200μg/mL的抗原量致敏3 h。綜上,本研究成功建立了RVFV間接血凝抗體檢測(cè)方法,該方法安全性高、操作簡(jiǎn)單、可用于批量樣本檢測(cè),為RVF新型疫苗的評(píng)價(jià)和疫病監(jiān)測(cè)提供了一種簡(jiǎn)便、快捷的檢測(cè)手段。
【圖文】：

圖 1-1 RVFV 基因結(jié)構(gòu)示意圖[9]Figure 1-1 Schematic of genome structure of RVFV[9]的流行狀況源性人獸共患傳染病。未出生的和幼齡反芻動(dòng)物感染后，病病死率達(dá) 20%，人感染后病死率約為 1%，有 5%的感染者會(huì)出炎。人可通過(guò)攜帶病毒的伊蚊、庫(kù)蚊等叮咬、接觸患病動(dòng)物肉、奶等感染；成年反芻動(dòng)物（牛、羊等）可通過(guò)蚊蟲(chóng)叮咬

圖 1-3 LAMP 原理示意圖[47]Figure 1-3 Schematic of the principle of LAMP[47]凝試驗(yàn)驗(yàn)（Indirect Heamagglutination assay，IHA）的原理是將制后加入檢測(cè)樣品，通過(guò)抗原抗體特異性反應(yīng)，使紅細(xì)胞聚集Feng 等人早在 1978 年利用間接血凝試驗(yàn)診斷棘球蚴病，檢性[53]。1985 年，，Yang 等人將日本血吸蟲(chóng)卵冷浸抗原液致敏，診斷血球于 4℃冰箱可保存 2 年以上，檢測(cè)結(jié)果與。1990 年，Luo 等人建立了間接血凝試驗(yàn)用于檢測(cè)鴨瘟病毒1993 年，Li 等人建立了用于檢測(cè)豬瘟病毒抗體的間接血凝，且與其他病原體無(wú)交叉反應(yīng)[56]。1996 年，Sun 等人建立接血凝試驗(yàn)，與中和試驗(yàn)相比陽(yáng)性符合率為 84.6%[57]。199菌致敏醛化后的綿羊紅細(xì)胞，建立間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)豬傳染價(jià)達(dá) 1:512~1:1024[58]。2001 年，Cai 等人以豬繁殖與呼吸綜樣本，與 ELISA 方法的符合率達(dá) 98%[59]。2003 年，Li 等分豬瘟抗體，結(jié)果表明兩者符合率為 84.8%，具有較高的相關(guān)
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李云峰;石靜;馬旭;葛藤;蔡鵬;薛芳;;基孔肯亞熱、克里米亞-剛果出血熱、裂谷熱病毒核酸液相芯片檢測(cè)方法的建立[J];中國(guó)國(guó)境衛(wèi)生檢疫雜志;2015年04期

2 張侖;殷幼平;王中康;;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的研究進(jìn)展[J];貴州農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年06期

3 陳瑋;;液相芯片技術(shù)的原理與應(yīng)用進(jìn)展[J];成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2008年03期

4 劉穎;冉多良;馬揚(yáng);;正向間接血凝試驗(yàn)監(jiān)測(cè)家畜O型口蹄疫抗體[J];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技;2007年19期

5 李金海,張東,王澤洲,馬孟根,張永寧,陳斌,張代芬,邢坤,楊林;用酶聯(lián)免疫吸附和正向間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)豬瘟抗體[J];四川畜牧獸醫(yī);2003年07期

6 蔡家利,藍(lán)希嵌,潘國(guó)慶;間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體[J];西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2001年01期

7 逯忠新,魯炳義,趙萍;用間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)豬傳染性胸膜肺炎[J];中國(guó)獸醫(yī)科技;1999年10期

8 孫泉云,李勁松;間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)鴨肝炎病毒抗體的研究[J];上海畜牧獸醫(yī)通訊;1996年05期

9 李樹(shù)春,何建新,李德珍,韓福祥,王威,李宏;豬瘟間接血凝試驗(yàn)的研究[J];中國(guó)獸醫(yī)科技;1993年07期

10 羅函祿,范文明,張菊英,石愛(ài)華,劉建萍;間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)鴨病毒性肝炎抗原和抗體的研究[J];中國(guó)家禽;1990年03期

本文編號(hào)：2708185