【摘要】：雞球蟲病(Coccidiosis)是由艾美耳屬(Eimeria)一種或多種球蟲所引發(fā)的原蟲病,呈全世界性分布。該病危害性大、感染率高,是造成世界范圍內(nèi)家禽業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的原因之一。目前該病的防治仍然以化學(xué)藥物和活疫苗為主,但由此導(dǎo)致的藥物殘留、耐藥性及新抗蟲藥開發(fā)困難等問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)峻�；钜呙绱嬖诙玖Ψ祻�(qiáng)、散毒等安全隱患,所以人們更加重視新型安全疫苗的研發(fā)。DNA疫苗具有安全、穩(wěn)定、易制備的優(yōu)點(diǎn),并通常將細(xì)胞因子作為佐劑與DNA疫苗共同免疫機(jī)體,從而達(dá)到增強(qiáng)疫苗免疫效果的目的。乳酸菌作為益生菌具有定殖力強(qiáng)、易于培養(yǎng)、免疫調(diào)節(jié)等特點(diǎn),可成為DNA疫苗的理想活載體,通過(guò)口服的方式將DNA疫苗遞送到機(jī)體細(xì)胞內(nèi),從而引發(fā)局部或全身的免疫反應(yīng)。為了提高乳酸菌對(duì)DNA疫苗的遞送效率,本研究以新型的真核質(zhì)粒pValac為表達(dá)載體,柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella,E.tenella)的微線體蛋白2(EtMIC2)為保護(hù)性抗原,以雞白介素18(ChIL18)作為佐劑構(gòu)建出重組質(zhì)粒,由表達(dá)金黃色葡萄球菌纖連蛋白A(FnBPA)的侵入型乳酸菌為載體遞送到雞體內(nèi),提高DNA疫苗的遞送效率,并對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的免疫水平及抗E.tenella保護(hù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:(1)表達(dá)EtMIC2蛋白和ChIL18的DNA疫苗構(gòu)建及體外驗(yàn)證參考GenBank登錄的EtMIC2及IL18序列,優(yōu)化并常規(guī)合成基因EtMIC2-IL18,通過(guò)PCR擴(kuò)增EtMIC2和EtMIC2-IL18基因片段,并分別連接至pValac載體上,雙酶切和堿基序列測(cè)定結(jié)果表明重組質(zhì)粒pValac-EtMIC2和pValac-EtMIC2-IL18構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞,Western blot和間接免疫熒光檢測(cè)EtMIC2和IL18蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。(2)攜帶DNA疫苗的侵入型乳酸菌的構(gòu)建及體外侵入能力檢測(cè)將pValac-EtMIC2和pValac-EtMIC2-IL18兩種真核質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至NC8-pSIP409、NC8-pSIP409-FnBPA重組乳酸菌感受態(tài)中,構(gòu)建出pValac-EtMIC2/pSIP409、pValac-EtMIC2/pSIP409-FnBPA、pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409、pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409-FnBPA四種菌株,經(jīng)SPPIP誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)后,通過(guò)Western blot檢測(cè)FnBPA蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果表明轉(zhuǎn)入真核質(zhì)粒后的侵入型乳酸菌的FnBPA蛋白成功表達(dá)。通過(guò)與分離的CEF細(xì)胞共培養(yǎng)2個(gè)小時(shí),洗滌后,室溫裂解10min,最后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞侵襲率。結(jié)果顯示pValac-EtMIC2/pSIP409-FnBPA菌株對(duì)CEF細(xì)胞的侵襲率達(dá)到0.25%,而pValac-EtMIC2/pSIP409作為對(duì)照菌株的侵襲率僅為0.09%。同樣pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409-FnBPA菌株對(duì)CEF細(xì)胞的侵襲率為0.15%,pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409菌株的侵襲率為0.08%。表達(dá)FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌的細(xì)胞侵襲率顯著高于非侵入型乳酸菌(P0.001)。(3)侵入型乳酸菌對(duì)雛雞免疫水平的影響及抗E.tenella保護(hù)效果評(píng)價(jià)健康的1日齡肉雛雞,隨機(jī)分為6組,每組20只,分別為生理鹽水組(GroupI)、攻蟲組(GroupII)、pValac/pSIP409組(GroupIII)、pValac-EtMIC2/pSIP409組(GroupIV)、pValac-EtMIC2/pSIP409-FnBPA組(GroupV)、pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409-FnBPA組(GroupVI)。在1、3、5、12、14、16日齡進(jìn)行口服免疫,每只免疫劑量為1×10~9CFU/200μL,并在30日齡進(jìn)行攻蟲(GroupI除外),攻蟲劑量為5×10~4個(gè)/只。對(duì)每組雛雞外周血CD3~+CD4~+及CD3~+CD8~+T淋巴細(xì)胞的發(fā)育情況、外周血中淋巴細(xì)胞增殖能力、腸道刮取物分泌型抗體SIgA、血清中特異性抗體及細(xì)胞因子含量進(jìn)行檢測(cè)。并對(duì)感染球蟲一周后雛雞的相對(duì)增重率、卵囊排出量、盲腸病變積分及抗球蟲指數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明,在30d(攻蟲前),與GroupI相比,GroupIV、GroupV、GroupVI雛雞外周血中的CD3~+CD4~+T淋巴細(xì)胞含量顯著較高(P0.05);在38d(攻蟲后),GroupV、GroupVI雛雞外周血中的CD3~+CD4~+T淋巴細(xì)胞含量均顯著高于GroupIII(P0.01)。同樣,在30d測(cè)得GroupVI雛雞外周血中的CD3~+CD8~+T淋巴細(xì)胞含量約35%,顯著高于GroupIII(P0.05);在38d測(cè)得GroupIV、GroupV、GroupVI均顯著高于GroupIII(P0.001),其中GroupVI含量最高約為43%。對(duì)各組雛雞外周血淋巴細(xì)胞增殖能力進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,攻蟲前后GroupVI增殖能力均最強(qiáng),在30d時(shí)GroupVI刺激指數(shù)約為1.3,顯著高于GroupIII(P0.001);在38d時(shí),GroupVI刺激指數(shù)約為1.5,同樣其增殖水平顯著高于GroupIII(P0.001)。本研究在攻蟲前對(duì)各組雛雞血清中細(xì)胞因子IL-4、IFN-γ、IL-18的含量進(jìn)行了檢測(cè),其中GroupVI雛雞的IFN-γ含量較其他免疫組高,顯著高于GroupIII(P0.01)。GroupVI中IL-18的含量顯著高于各組(P0.001)。GroupVI腸道刮取物中SIgA的分泌量最高,且顯著高于GroupV(P0.05)。攻蟲后,GroupV、GroupVI平均體重增長(zhǎng)水平較高,相對(duì)于GroupI相對(duì)增重率分別為79.66%、84.75%。GroupIV、GroupV、GroupVI糞便中卵囊排出量明顯減少,其相對(duì)于GroupII卵囊減少率分別為67.73%、69.75%、76.16%。攻蟲一周后觀察發(fā)現(xiàn)GroupIV、GroupV、GroupVI雛雞的盲腸病變明顯減輕,平均計(jì)分分別為1.3、1.1、0.9。最后得出各組ACI值,GroupIV、GroupV、GroupVI分別為162.27、167.66、174.75,均能達(dá)到良好的抗球蟲效果,GroupVI效果最佳。本研究基于表達(dá)FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌為載體,攜帶pValac-EtMIC2-IL18真核質(zhì)粒遞送到宿主體內(nèi),并能提高機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫,增強(qiáng)機(jī)體對(duì)球蟲的抵抗能力。以侵入型乳酸菌為載體遞送DNA疫苗的方式為球蟲的防治提供了新思路和新方法。
【圖文】：

組乳酸菌與 CEF 細(xì)胞共培養(yǎng)MIC2/pSIP409、pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409、pValac-EtMIC2/pSI2-IL18/pSIP409-FnBPA 重 組 菌 培 養(yǎng) 三 個(gè) 小 時(shí) ， 然 后 pVaA、pValac-EtMIC2-IL18/ pSIP409-FnBPA 這兩種菌株各加 125μLL 菌液，并用 1mLPBS 懸起。細(xì)胞鋪于 24 孔板中，每孔加對(duì)應(yīng)的菌，剩余的菌液 105、106、107梯度滴板，將 24 孔細(xì)胞板 1000g 離CO2溫箱中培養(yǎng) 2h，然后 PBS 洗 3 遍，每孔加含 F12 的 DMEM霉素）1mL，培養(yǎng) 2h，PBS 洗 3 次，然后加入 300μL、2%Trit比稀釋滴板并計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果及相應(yīng)公式最終得到細(xì)胞侵、EtMIC2-IL18 基因的擴(kuò)增 公司優(yōu)化并常規(guī)合成基因 EtMIC2-IL18，制備出穿刺菌。經(jīng)活設(shè)計(jì)合成引物，對(duì) EtMIC2、EtMIC2-IL18 基因進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖 1.1、1.2 顯示，在預(yù)期大小出現(xiàn)目M 1M 1

組乳酸菌與 CEF 細(xì)胞共培養(yǎng)MIC2/pSIP409、pValac-EtMIC2-IL18/pSIP409、pValac-EtMIC2/pSI2-IL18/pSIP409-FnBPA 重 組 菌 培 養(yǎng) 三 個(gè) 小 時(shí) ， 然 后 pVaA、pValac-EtMIC2-IL18/ pSIP409-FnBPA 這兩種菌株各加 125μLL 菌液，并用 1mLPBS 懸起。細(xì)胞鋪于 24 孔板中，每孔加對(duì)應(yīng)的菌，剩余的菌液 105、106、107梯度滴板，將 24 孔細(xì)胞板 1000g 離CO2溫箱中培養(yǎng) 2h，然后 PBS 洗 3 遍，，每孔加含 F12 的 DMEM霉素）1mL，培養(yǎng) 2h，PBS 洗 3 次，然后加入 300μL、2%Trit比稀釋滴板并計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果及相應(yīng)公式最終得到細(xì)胞侵、EtMIC2-IL18 基因的擴(kuò)增 公司優(yōu)化并常規(guī)合成基因 EtMIC2-IL18，制備出穿刺菌。經(jīng)活設(shè)計(jì)合成引物，對(duì) EtMIC2、EtMIC2-IL18 基因進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖 1.1、1.2 顯示，在預(yù)期大小出現(xiàn)目M 1M 1
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.4

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本文編號(hào)：2707743