發(fā)布時間：2020-06-11 09:57

【摘要】：犬小孢子菌(Microsporum Canis)是一種常見的人畜共患皮膚癬菌,主要感染皮膚、毛發(fā)和甲等角化組織,引起淺部真菌病。在真菌的生長和繁殖中,鋅是一種必須微量元素,參與許多生物過程,對真菌的生長和代謝具有重要作用。在病原真菌與宿主相互作用過程中,宿主的營養(yǎng)免疫限制病原真菌對鋅的攝取,為了能在鋅限制條件下存活和增殖,病原真菌進化出特殊的鋅穩(wěn)態(tài)調(diào)控機制。鋅響應(yīng)激活蛋白(Zap1)及其同系物是調(diào)節(jié)鋅穩(wěn)態(tài)基因的主要轉(zhuǎn)錄因子,在釀酒酵母、煙曲霉、念珠菌等真菌中已被證實。但目前鋅缺乏對犬小孢子菌基因表達的影響尚不清楚,關(guān)于犬小孢子菌鋅響應(yīng)激活蛋白參與的生物過程尚不明確。確定鋅缺乏對犬小孢子的影響,明確鋅響應(yīng)轉(zhuǎn)錄激活因子在犬小孢子菌鋅穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中的作用,對犬小孢子菌鋅穩(wěn)態(tài)調(diào)控的相關(guān)研究具有重要意義。本試驗通過對正常組(NORM)和鋅限制條件下(Zn200和Zn800)生長的犬小孢子菌進行轉(zhuǎn)錄組測序,對所得數(shù)據(jù)進行的原始數(shù)據(jù)質(zhì)控、比對分析、表達定量分析、差異表達分析、差異表達基因的功能富集和注釋等,明確鋅缺乏對犬小孢子菌基因表達的影響。通過根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)構(gòu)建了犬小孢子菌鋅響應(yīng)轉(zhuǎn)錄激活因子Zrta基因缺失株,為后續(xù)Zrta基因功能分析奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下;1.獲得大量基因數(shù)據(jù),差異表達基因數(shù)目統(tǒng)計顯示,Zn800組和Zn200組與NORM組相比,上調(diào)基因分別為798、764個,下調(diào)基因分別為585、631個,其中MCYG_04486、MCYG_06235在鋅限制組與正常組相比中均顯著上調(diào),MCYG_02504只在Zn200中顯著上調(diào);Zn800組與Zn200組相比上下調(diào)基因的數(shù)目分別為3個和8個。差異表達基因功能注釋分析表明MCYG_06235(zinc-responsiveness transcriptional activator)可能為重要的鋅轉(zhuǎn)運因子。2.高保真擴增了犬小孢子菌鋅響應(yīng)轉(zhuǎn)錄激活因子基因MCYG_06235(zinc-responsiveness transcriptional activator,Zrta),構(gòu)建了含有Zrta基因兩側(cè)同源片段及潮霉素B抗性基因(hph)的雙元載體pDHt/ZrtaⅠ、Ⅱ::hph,酶切和PCR驗證證實雙元載體構(gòu)建成功。3.構(gòu)建成功的雙元載體轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌中,PCR結(jié)果驗證轉(zhuǎn)化成功后,用帶有雙元載體的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化犬小孢子菌,通過PCR和Southern blot對轉(zhuǎn)化子進行鑒定,篩選出犬小孢子菌Zrta基因與潮霉素B抗性基因發(fā)生同源重組的菌株,獲取的Zrta基因缺失株連續(xù)3次傳代培養(yǎng)后,遺傳性狀穩(wěn)定。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序明確了鋅缺乏對犬小孢子菌基因表達和生物代謝等的影響,其中Zrta基因的基因注釋結(jié)果表明其在鋅代謝中可能起關(guān)鍵作用,成功構(gòu)建了Zrta基因轉(zhuǎn)化用的雙元載體pDHt/ZrtaⅠ、Ⅱ::hph,通過ATMT成功獲得犬小孢子菌Zrta基因缺失株,為Zrta基因的致病性和功能驗證奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

６５００邋ｒ／ｍｉｎ邋５邋ｍｉｎ，盡最棄上清逡逑冰上晾干１00１丨１１，加入１１冊２0溶解１＾八，－８0。（：保存逡逑圖２－１邋ＲＮＡ提取步驟逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋ＲＮＡ邋ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ邋ｓｔｅｐｓ逡逑２．２．３邋ｃＤＮＡ文庫構(gòu)建及測序逡逑提取出的犬小孢子菌Ｚｎ２００組、Ｚｎ８００組和Ｎｏｒｍ組總ＲＮＡ，進行ｃＤＮＡ文庫的逡逑構(gòu)建和高通量測序＿具體操作步驟如圖２－２。逡逑１５逡逑

２．３．１犬小孢子菌在正常培養(yǎng)基和鋅限制培養(yǎng)基上的生長逡逑犬小孢子菌在正常培養(yǎng)基和含有不同濃度的鋅培養(yǎng)基中表現(xiàn)出不同的生長狀況逡逑（圖２－４），肉眼觀察可見Ｚｎ２００組、Ｚｎ４００組、Ｚｎ６００組、Ｚｎ８００組和ＺｎｌＯＯＯ組培養(yǎng)逡逑基中均有白色菌落形成，菌落由中伺向四周輻射，直徑隨培養(yǎng)基中鋅的濃度增加而增逡逑：大：ａ邋Ｚｎ２０．０組和Ｚｎ４００組菌落較小，表面光滑，中央接種處．呈丘租凸起Ｚｎ６０0ｆｉ＿逡逑Ｚｎ８００組菌落表面有掏眼Ｗ見的絲狀形態(tài)＊呈，

本文編號：2707736