發(fā)布時間：2020-06-11 09:57

【摘要】：犬小孢子菌(Microsporum Canis)是一種常見的人畜共患皮膚癬菌,主要感染皮膚、毛發(fā)和甲等角化組織,引起淺部真菌病。在真菌的生長和繁殖中,鋅是一種必須微量元素,參與許多生物過程,對真菌的生長和代謝具有重要作用。在病原真菌與宿主相互作用過程中,宿主的營養(yǎng)免疫限制病原真菌對鋅的攝取,為了能在鋅限制條件下存活和增殖,病原真菌進化出特殊的鋅穩(wěn)態(tài)調控機制。鋅響應激活蛋白(Zap1)及其同系物是調節(jié)鋅穩(wěn)態(tài)基因的主要轉錄因子,在釀酒酵母、煙曲霉、念珠菌等真菌中已被證實。但目前鋅缺乏對犬小孢子菌基因表達的影響尚不清楚,關于犬小孢子菌鋅響應激活蛋白參與的生物過程尚不明確。確定鋅缺乏對犬小孢子的影響,明確鋅響應轉錄激活因子在犬小孢子菌鋅穩(wěn)態(tài)調節(jié)中的作用,對犬小孢子菌鋅穩(wěn)態(tài)調控的相關研究具有重要意義。本試驗通過對正常組(NORM)和鋅限制條件下(Zn200和Zn800)生長的犬小孢子菌進行轉錄組測序,對所得數(shù)據(jù)進行的原始數(shù)據(jù)質控、比對分析、表達定量分析、差異表達分析、差異表達基因的功能富集和注釋等,明確鋅缺乏對犬小孢子菌基因表達的影響。通過根癌農桿菌介導的遺傳轉化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)構建了犬小孢子菌鋅響應轉錄激活因子Zrta基因缺失株,為后續(xù)Zrta基因功能分析奠定基礎。研究結果如下;1.獲得大量基因數(shù)據(jù),差異表達基因數(shù)目統(tǒng)計顯示,Zn800組和Zn200組與NORM組相比,上調基因分別為798、764個,下調基因分別為585、631個,其中MCYG_04486、MCYG_06235在鋅限制組與正常組相比中均顯著上調,MCYG_02504只在Zn200中顯著上調;Zn800組與Zn200組相比上下調基因的數(shù)目分別為3個和8個。差異表達基因功能注釋分析表明MCYG_06235(zinc-responsiveness transcriptional activator)可能為重要的鋅轉運因子。2.高保真擴增了犬小孢子菌鋅響應轉錄激活因子基因MCYG_06235(zinc-responsiveness transcriptional activator,Zrta),構建了含有Zrta基因兩側同源片段及潮霉素B抗性基因(hph)的雙元載體pDHt/ZrtaⅠ、Ⅱ::hph,酶切和PCR驗證證實雙元載體構建成功。3.構建成功的雙元載體轉化入根癌農桿菌中,PCR結果驗證轉化成功后,用帶有雙元載體的根癌農桿菌轉化犬小孢子菌,通過PCR和Southern blot對轉化子進行鑒定,篩選出犬小孢子菌Zrta基因與潮霉素B抗性基因發(fā)生同源重組的菌株,獲取的Zrta基因缺失株連續(xù)3次傳代培養(yǎng)后,遺傳性狀穩(wěn)定。本研究通過轉錄組測序明確了鋅缺乏對犬小孢子菌基因表達和生物代謝等的影響,其中Zrta基因的基因注釋結果表明其在鋅代謝中可能起關鍵作用,成功構建了Zrta基因轉化用的雙元載體pDHt/ZrtaⅠ、Ⅱ::hph,通過ATMT成功獲得犬小孢子菌Zrta基因缺失株,為Zrta基因的致病性和功能驗證奠定了基礎。
【圖文】：

６５００邋ｒ／ｍｉｎ邋５邋ｍｉｎ，盡最棄上清逡逑冰上晾干１00１丨１１，加入１１冊２0溶解１＾八，－８0。（：保存逡逑圖２－１邋ＲＮＡ提取步驟逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋ＲＮＡ邋ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ邋ｓｔｅｐｓ逡逑２．２．３邋ｃＤＮＡ文庫構建及測序逡逑提取出的犬小孢子菌Ｚｎ２００組、Ｚｎ８００組和Ｎｏｒｍ組總ＲＮＡ，進行ｃＤＮＡ文庫的逡逑構建和高通量測序＿具體操作步驟如圖２－２。逡逑１５逡逑

２．３．１犬小孢子菌在正常培養(yǎng)基和鋅限制培養(yǎng)基上的生長逡逑犬小孢子菌在正常培養(yǎng)基和含有不同濃度的鋅培養(yǎng)基中表現(xiàn)出不同的生長狀況逡逑（圖２－４），肉眼觀察可見Ｚｎ２００組、Ｚｎ４００組、Ｚｎ６００組、Ｚｎ８００組和ＺｎｌＯＯＯ組培養(yǎng)逡逑基中均有白色菌落形成，菌落由中伺向四周輻射，直徑隨培養(yǎng)基中鋅的濃度增加而增逡逑：大：ａ邋Ｚｎ２０．０組和Ｚｎ４００組菌落較小，表面光滑，中央接種處．呈丘租凸起Ｚｎ６０0ｆｉ＿逡逑Ｚｎ８００組菌落表面有掏眼Ｗ見的絲狀形態(tài)＊呈，

本文編號：2707736