【摘要】：口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一種豬、牛、羊等偶蹄動物急性、高度傳染性的疾病。鑒于口蹄疫能夠?qū)π竽翗I(yè)生產(chǎn)造成嚴重經(jīng)濟損失,世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定報告動物疫病,在我國為一類動物疫病。當前研究已證實FMDV編碼的非結構蛋白L~(pro)、3A、3C~(pro),和結構蛋白VP1等具有抑制宿主先天性免疫應答的特性,但非結構蛋白2B、3B是否在抑制宿主天然免疫應答中發(fā)揮作用尚屬未知。因此本研究主要對FMDV 2B、3B在天然免疫應答過程中的作用開展研究,以期闡明其在RIG-Ⅰ樣受體(RIG-Ⅰ like receptors,RLR)介導的Ⅰ型干擾素應答中是否具有抑制作用及其作用機制。本研究利用反轉(zhuǎn)錄實時定量PCR(RT-qPCR)和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)FMDV 2B能顯著降低HEK293T細胞中IFN-β、IL-6、ISG15的mRNA水平,并且能夠顯著抑制由Poly(I:C)誘導或SeV觸發(fā)的IFN-β、NF-κB、ISRE啟動子的激活,結果表明2B能抑制Ⅰ型干擾素和促炎細胞因子的轉(zhuǎn)錄激活。為探究FMDV 2B通過何種機制抑制HEK293T細胞中RLR介導的Ⅰ型干擾素應答,通過磷酸化檢測發(fā)現(xiàn)FMDV 2B過表達后能抑制HEK293T細胞中TBK1和IRF3的磷酸化水平;免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)和Pull-Down實驗結果表明FMDV 2B可與RIG-Ⅰ樣受體RIG-Ⅰ、MDA5相互作用;此外,在HEK293T細胞中過表達2B后發(fā)現(xiàn),FMDV2B能抑制RIG-Ⅰ、MDA5的轉(zhuǎn)錄水平,并能夠抑制外源性和內(nèi)源性RIG-Ⅰ、MDA5在蛋白水平表達,但不抑制VISA、TBK1、IRF3的表達。本研究還發(fā)現(xiàn)在HEK293T細胞中過表達FMDV 3B能顯著抑制IFN-β、IL-6、ISG15的轉(zhuǎn)錄,并降低由Poly(I:C)誘導或SeV觸發(fā)的IFN-β、NF-κB、ISRE啟動子的激活。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻?FMDV 3B在RIG-Ⅰ和MDA5水平調(diào)節(jié)RLR介導的Ⅰ型干擾素應答;RT-qPCR實驗結果顯示FMDV 3B過表達能下調(diào)RIG-Ⅰ、MDA5的轉(zhuǎn)錄水平。同時,我們發(fā)現(xiàn)FMDV 3B1/3B2/3B3三種蛋白均能抑制HEK293T細胞中Ⅰ型干擾素相關啟動子的活化。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)FMDV 2B能與RIG-Ⅰ和MDA5相互作用,并抑制RIG-Ⅰ和MDA5的轉(zhuǎn)錄、表達;此外,FMDV 2B能抑制RLR信號通路中TBK1和IRF3的磷酸化,從而抑制Ⅰ型干擾素的表達。另外,FMDV 3B對HEK293T細胞中的Ⅰ型干擾素應答也具有抑制作用,并且FMDV3B1/3B2/3B3三種蛋白均能夠抑制Ⅰ型干擾素相關啟動子的活化。本研究結果可以進一步提高我們對FMDV逃避宿主免疫系統(tǒng)機制的理解,同時也為開發(fā)新型口蹄疫疫苗以及制定更加有效的口蹄疫防控策略提供借鑒。
【圖文】：

.1 RLRs 信號傳導途徑誘導 IFN-α/β 產(chǎn)生（引自文獻 Courtney Wilkins et aFig 1.1 The RLR signaling pathway induce IFN-α/β production導基因 I鑒定為在維甲酸治療急性早幼粒細胞白血病中的誘導基因。隨

圖 1.2 RLRs 的結構示意圖（引自文獻 Yueh-Ming Loo1 et al.，，2011）Fig 1.2 Structural Representation of the RLRs蹄疫簡介疫（foot-and-mouthdisease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouthdiseasevirus
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.65

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本文編號：2707068