【摘要】：貯精腺(sperm storage tubules,SSTs)是禽類(lèi)特有的管狀腺體,位于生殖道子宮陰道交界處,主要功能是長(zhǎng)期儲(chǔ)存精子并維持其活力,使禽類(lèi)能持續(xù)生產(chǎn)受精蛋。貯精腺存在大量的碳酸酐酶,其中碳酸酐酶4(CAⅣ)在子宮陰道交接部大量表達(dá),由此推測(cè)CAⅣ可能參與禽類(lèi)精子儲(chǔ)存,因此研究CAⅣ在貯精腺長(zhǎng)期儲(chǔ)存精子過(guò)程中的功能對(duì)探究禽類(lèi)貯精腺長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存精子并維持其活力的生理機(jī)制具有重要意義。本試驗(yàn)分析雞CAⅣ序列的生物信息,尋找蛋白的抗原表位,構(gòu)建pVAX-CAⅣ-asd重組質(zhì)粒,并按不同劑量免疫母雞。將105只38周齡產(chǎn)蛋母雞隨機(jī)分為7組,每組15只,第1到第5組依次免疫10、50、100、150、200μg的pVAX-CAⅣ-asd重組質(zhì)粒,第6組免疫100μg的pVAX-asd空質(zhì)粒,第7組注射生理鹽水,每組免疫2次,免疫間隔為21天。試驗(yàn)期內(nèi)每天收集種蛋,記錄產(chǎn)蛋量,每周采集血液,檢測(cè)母雞血清中CAⅣ抗體含量、L-乳酸含量以及母雞生殖部CAⅣ mRNA和MCT4 mRNA的表達(dá)量,測(cè)定母雞的體重,記數(shù)蛋黃膜的精子穿孔數(shù),計(jì)算受精率。結(jié)果表明:1.雞CAⅣ由316個(gè)氨基酸構(gòu)成,是親水性較強(qiáng)的膜結(jié)合蛋白,二級(jí)結(jié)構(gòu)上α螺旋和β折疊較多,且抗原表位豐富,存在信號(hào)肽。CAⅣ蛋白有多個(gè)絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)及3個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn),并且第165位的天冬酰胺可能為糖基化位點(diǎn)。進(jìn)化分析表明雞與火雞CAⅣ最有可能來(lái)源于同一祖先,它們的CAⅣ氨基酸序列相似性最高,為94.01%,其后依次是珍珠雞、鵪鶉、大雁和綠頭野鴨,與綠頭野鴨的序列相似度最低,為84.35%,表明禽類(lèi)CAⅣ具有較高的序列保守性。2.實(shí)驗(yàn)組血清中抗CAⅣ的抗體水平從第7 d至實(shí)驗(yàn)結(jié)束均顯著高于兩個(gè)對(duì)照組,并在免疫后第28 d達(dá)到峰值,之后抗體水平逐漸減少(p0.05)。3.用CAⅣ重組質(zhì)粒免疫母雞,實(shí)驗(yàn)組母雞UVJ部位的CAⅣ mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于空載體對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組傘部CAⅣ mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于注射生理鹽水對(duì)照組,第4-5組母雞UVJ部位MCT4 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于生理鹽水對(duì)照組,5個(gè)實(shí)驗(yàn)組傘部MCT4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著低于生理鹽水對(duì)照組(p0.05)。4.免疫組與對(duì)照組母雞體重和產(chǎn)蛋量沒(méi)有顯著差異(p0.05),從免疫第2周開(kāi)始,200ug劑量組種蛋受精率顯著降低(p0.05)。免疫后實(shí)驗(yàn)組的精子穿孔數(shù)顯著降低(p0.05),L-乳酸也減少(p0.05)。綜上,CAⅣ重組質(zhì)粒免疫母雞不影響體重,降低CAⅣ和MCT4的mRNA表達(dá)量,可降低種蛋受精率、血清L-乳酸含量、蛋黃膜上的精子穿孔數(shù),因此CAⅣ可能與MCT4共同作用,為長(zhǎng)期維持精子活力提供適宜的微環(huán)境。
【圖文】：

表 2-2 不同物種間禽類(lèi) CAIV 序列相似度對(duì)比Table.2-2 Comparison of chicken CAIV sequence similarity between 6 bird species物種Species相似度（%）Similarity（%）雞（Gallus gallus） 100%火雞（Melegris gallopavo） 94.01%鵪鶉（Coturnix japonica） 92.74%珍珠雞（Numida meleagris）大雁（Anser cygnoides）綠頭野鴨（Anas platyrhynchos）91.38%85.55%84.35%根據(jù) CAⅣ蛋白序列構(gòu)建不同禽類(lèi)的聚類(lèi)樹(shù)（圖 2-1），該聚類(lèi)樹(shù)上存在兩個(gè)的類(lèi)群（clusters），分別是陸禽和水禽，這與動(dòng)物分類(lèi)學(xué)的分類(lèi)結(jié)果一致。在中，雞 CAIV 與火雞離的距離最近，親緣關(guān)系最為密切，說(shuō)明它們可能起源于個(gè)祖先。

圖 2-2 雞 CAⅣ的親水性和疏水性橫坐標(biāo)代表氨基酸位置，縱坐標(biāo)代表數(shù)值，疏水性由正值表示，該值越大表示疏水性越強(qiáng)，反之，負(fù)值代表親水性。Fig.2-2 Hydrophobicity/hydrophility of chicken CAⅣThe abscissa represents the amino acid position, and the ordinate represents the value. Thehydrophobicity is represented by a positive value. The larger the value is, the greater thehydrophobicity is, and the negative value represents the hydrophilicity.2.3.4 雞 CAIV 的的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析從圖 2-3 可以看出，分析雞 CAIV 的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，雞 CAⅣ的 α 螺旋（紅色區(qū)域）最多，共有 221 個(gè)，主要集中在氨基酸位置的第 14~18、27~32、41~49、86~89、110~111、113~119、124~128、139~147、152~~167、188~193、200~209、218~221、270~280、292~299 處；β 折疊（綠色區(qū)域）共有 132 個(gè)，大多數(shù)在氨基酸位置的第3~13、19~26、57~72、230~261、300~314 處；β 轉(zhuǎn)角（藍(lán)色區(qū)域）有 43 個(gè)，位置
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S831

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本文編號(hào)：2707059