發(fā)布時間：2020-06-11 00:04

【摘要】：埃里希氏體病屬于一類由蜱傳播的自然疫源性疾病,隨著病原種類的增加,新病型的出現(xiàn)以及人的感染,引起了全球?qū)W者的重視。當(dāng)前存在三大急需解決的科學(xué)問題:(1)目前國內(nèi)尚未針對埃里希氏體病進(jìn)行系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查,蜱作為該病的唯一傳播媒介,調(diào)查蜱攜帶埃里希氏體情況具有重要的經(jīng)濟(jì)及公共衛(wèi)生學(xué)意義。(2)對于埃里希氏體病的血清學(xué)診斷方法國內(nèi)尚未有過報道,該病臨床癥狀不典型且與某些病毒性疾病相似,由于缺乏有效診斷方式,染病動物不能及時確診就醫(yī),往往錯過最佳治療時機(jī)。(3)該病目前并無商品化疫苗可用。研究人員對埃里希氏體疫苗的研發(fā)主要集中在弱毒疫苗、亞單位疫苗及核酸疫苗方面,然而隨著毒株基因型的增多,單一抗原或單一毒株不能產(chǎn)生完全的保護(hù)效應(yīng)。針對以上問題,本研究對我國部分地區(qū)蜱攜帶埃里希氏體情況進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查,為該病原的分布情況提供一定數(shù)據(jù);建立了E.canis抗體檢測間接ELISA方法并初步應(yīng)用于臨床,以期提供簡便、快捷、有效的臨床診斷方法;采用E.canis gp36序列全長替換NDV HN蛋白胞外域的策略,與NDV M蛋白形成嵌合病毒樣顆粒cVLPs-HNcgp36,并對其進(jìn)行免疫原性分析,為E.canis新型疫苗的研制提供新的策略。主要研究內(nèi)容如下:1、我國部分地區(qū)蜱攜帶埃里希氏體分子流行病學(xué)調(diào)查本研究于2016-2018年間在我國內(nèi)蒙古自治區(qū)、黑龍江省、吉林省、浙江省和海南省五個省份牛、羊、犬及黃鼠體表采集蜱蟲樣品1142份,采用埃里希氏體16S rRNA、dsb和gp36基因相關(guān)引物對蜱蟲基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定,共發(fā)現(xiàn)10組陽性樣品,經(jīng)遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),陽性樣品屬于3個種:E.ruminantium(2組)、E.muris(2組)和E.canis(6組)。內(nèi)蒙古自治區(qū)陽性率為0%(0/54);黑龍江省陽性率為0.7%(1/144);吉林省陽性率為4.1%(3/74);浙江省陽性率為0%(0/8);海南省陽性率為28.6%(6/21)。2、E.canis抗體檢測間接ELISA方法的建立及初步應(yīng)用本研究利用大腸桿菌表達(dá)E.canis P30蛋白,以此為包被抗原建立了E.canis抗體檢測間接ELISA方法。并采用該方法對來自我國北京市、上海市、吉林省、遼寧省和江西省的172份犬血清樣品進(jìn)行檢測,5省市犬血清樣品平均感染率為26.74%。隨后,選取本研究所建立間接ELISA方法檢測為埃里希氏體抗體陽性的犬血清33份,陰性血清37份,采用美國IDEXX公司的SNAP*4Dx*PLUS試劑盒再次進(jìn)行檢測,兩者符合度為92.86%(κ=0.856)。綜上,本研究建立的E.canis抗體檢測間接ELISA方法與商品化試劑盒符合度較高,可用于臨床樣品的檢測,為犬埃里希氏體病的診斷提供了技術(shù)支持。3、E.canis嵌合VLPs的構(gòu)建及免疫原性研究本研究利用昆蟲-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),采用E.canis gp36全長替換NDV HN蛋白胞外域的策略,與NDV M蛋白形成嵌合病毒樣顆粒cVLPs-HNcgp36。經(jīng)Western blot鑒定,蛋白表達(dá)正確。透射電鏡下,可見直徑80-200nm的病毒樣粒子。隨后采用腹腔注射的方式對C57BL/6小鼠進(jìn)行免疫,通過檢測小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫水平,對其進(jìn)行免疫原性分析。結(jié)果顯示,體液免疫方面,cVLPs-HNcgp36組與可溶性蛋白組相比能夠誘導(dǎo)更高的抗體滴度;細(xì)胞免疫方面,cVLPs-HNcgp36組CD3~+CD4~+和CD3~+CD8~+T淋巴細(xì)胞比例均顯著高于其他三組。綜上,本研究所構(gòu)建的嵌合病毒樣顆粒cVLPs-HNcgp36與可溶性蛋白相比有著更好的免疫原性,為E.canis新型疫苗的研制提供了新的策略。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.4

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本文編號：2707070