【摘要】：FHL3(Four and a half LIM domain protein 3)屬于LIM蛋白質(zhì)超家族,主要在骨骼肌中表達,能夠通過LIM結(jié)構(gòu)域與肌分化因子MyoD、肌動蛋白、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子等多種蛋白的互作,調(diào)控成肌細(xì)胞分化、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、肌細(xì)胞的形成以及下游基因的表達。本研究利用實驗室前期建立的轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠模型,研究了過表達FHL3基因?qū)±w維類型轉(zhuǎn)化和肌肉生長的作用,具體研究結(jié)果如下:1.對實驗室前期獲得的F1代轉(zhuǎn)基因小鼠進行了鑒定,完成了3個家系的轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠的建系工作,擴繁至第5代。轉(zhuǎn)基因小鼠的后代性別比例均衡,陽性率隨傳代增加逐步升高,至第5代達到90%以上,外源基因能夠穩(wěn)定遺傳。同時,轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)仔能力,與野生型小鼠無顯著差異。利用實時定量PCR和Western Blot技術(shù),分析2月齡轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟、肝臟、腎臟、肌肉和睪丸組織中FHL3基因的表達變化,結(jié)果表明FHL3基因在轉(zhuǎn)基因小鼠的肌肉組織中特異性高表達。2.對轉(zhuǎn)基因鼠的體重增長進行檢測,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因鼠的初生重與野生型小鼠無顯著差異,出生后1~8周的生長速度和肌肉比例極顯著高于野生鼠。HE染色和免疫熒光結(jié)果顯示股四頭肌、脛骨前肌、腓腸肌的肌纖維數(shù)目增多,橫截面積增大、密度減小。ATP酶染色和免疫組化的結(jié)果表明腓腸肌中II型快肌纖維增多,I型慢肌纖維減少。對轉(zhuǎn)基因小鼠進行力學(xué)測試,結(jié)果顯示其肌肉拉力增強,耐疲勞能力下降。轉(zhuǎn)基因小鼠心臟大小和重量與野生鼠無異,HE染色顯示,轉(zhuǎn)基因小鼠心肌發(fā)育正常,心肌尺寸與野生鼠無明顯差異,同時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中FHL3基因的mRNA水平顯著上調(diào)表達,但蛋白水平無顯著變化。3.對轉(zhuǎn)基因小鼠腓腸肌中FHL3和肌纖維類型相關(guān)基因進行了轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的分析。結(jié)果顯示:在mRNA水平,1、2和3月齡轉(zhuǎn)基因小鼠腓腸肌中FHL3基因極顯著上調(diào)表達,I型肌纖維相關(guān)基因MyHC I/slow的表達極顯著下調(diào),II型肌纖維相關(guān)基因MyHC IIa、IIb、IIx顯著上調(diào)表達。在蛋白水平,2月齡轉(zhuǎn)基因小鼠腓腸肌中FHL3、MyHC、MyHC IIa和IIb蛋白極顯著上調(diào)表達,MyHC I/slow和Myoglobin顯著下調(diào)表達。同時對線粒體功能相關(guān)基因PGC1-α、COX2、COX4、AMPK和CS,糖酵解相關(guān)基因PDK4,介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解的泛素連接酶Atrogin-1,Murf1和Musa1以及肌肉生長發(fā)育相關(guān)基因Myf5、Myf6、MSTN、MEF2c的表達變化進行檢測,PGC1-α、COX4、PDK4、Myf5、Myf6、MEF2c的表達顯著上調(diào),MSTN極顯著下調(diào)表達。這些結(jié)果證明了轉(zhuǎn)基因小鼠的肌纖維類型的轉(zhuǎn)化,線粒體功能增強,能量轉(zhuǎn)化和利用率提高。4.分離鑒定了轉(zhuǎn)FHL3基因小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞,通過實時定量PCR、Western Blot、流式細(xì)胞術(shù)和RTCAxCELLigence系統(tǒng)對肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖能力進行了分析,結(jié)果表明過表達FHL3基因促進肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖,促進轉(zhuǎn)基因小鼠的肌纖維數(shù)目和肌肉量增多。綜上所述,本研究在活體水平上驗證了FHL3基因具有促進肌纖維類型轉(zhuǎn)化以及提高肌肉生長和重量的功能,為深入研究FHL3基因調(diào)控肌纖維類型轉(zhuǎn)化的機制提供了新的思路。
【圖文】：

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆碩士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文但不同的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)決定著骨骼肌干細(xì)胞的誕生（Sambasivan et al.,2007）。對肌原性調(diào)節(jié)因子（MyoD）家族：MyoD，Myf5，肌細(xì)胞生成素 MyOG 和 MRF4 的鑒定，發(fā)現(xiàn)它們在肌肉前體細(xì)胞群的形成以及這些細(xì)胞在胚胎中的分化中起關(guān)鍵作用，通過基因敲除實驗證明該家族的基因是肌衛(wèi)星細(xì)胞形成的上游決定因子，而肌細(xì)胞生成素是大多數(shù)肌細(xì)胞分化所需的（Tajbakhsh and Buckingham,1999）。Pax7 基因在胚胎發(fā)育中期即開始調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞和成肌祖細(xì)胞，同時 Pax3 和 Pax7 基因主要是在調(diào)節(jié)產(chǎn)前和圍產(chǎn)期的肌肉中發(fā)揮重要作用（Harel et al.,2009）。大量的研究報道了肌衛(wèi)星細(xì)胞參與肌肉的維持與再生，在肌肉損傷修復(fù)中意義重大（Yue et al.,2016），但肌衛(wèi)星細(xì)胞的再生能力并非用之不盡，例如先天性的杜氏肌營養(yǎng)不良綜合征患者，衛(wèi)星細(xì)胞群體的不斷消耗會導(dǎo)致病情惡化，最終死亡（Shi et al.,2007）。在成年個體中，促進靜息的肌衛(wèi)星細(xì)胞的活化，增殖，，能夠分化為肌細(xì)胞，對肌萎縮等惡病質(zhì)造成的消瘦有非常好的治療效果（Kivel et al.,2016）。

FHL3 基因調(diào)控肌肉生長和肌纖維類型轉(zhuǎn)化的功能研究（Karlsson et al.,1990）。Kosa等研究發(fā)現(xiàn)，LIM家族的蛋6 23 H X2CX2CX2CX16 21CX2-3 (C/H/D)氨基酸保守序的研究顯示具有高度保守序列的LIM結(jié)構(gòu)域，是由兩個指結(jié)構(gòu)串聯(lián)而成，具有穩(wěn)定的三級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)（Ostendo對功能研究的深入，發(fā)現(xiàn)LIM基序雖然含有共有序列/H]x2-4[C/H/E]x2Cx2Cx14-21[C/H]x1-3 [C/H/D/E])，但并通過介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用來發(fā)揮功能（Kadrmas a綜合前人的研究結(jié)果，LIM結(jié)構(gòu)域是介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子、信關(guān)蛋白質(zhì)之間的相互作用的主要區(qū)域，是該基因家族發(fā)
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S813.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 劉培峰;馮佳煒;段曉雪;牟韶陽;徐良梅;;肌纖維類型及其轉(zhuǎn)化對畜禽肉品質(zhì)的影響[J];中國飼料;2015年16期

2 王曉建;楊旭;宋曉東;張禪那;劉繼斌;邸冉;張連峰;惠汝太;;實時熒光定量PCR法檢測轉(zhuǎn)基因小鼠拷貝數(shù)[J];中國實驗動物學(xué)報;2007年03期

3 楊曉靜,趙茹茜,陳杰,胥清富,韋習(xí)會,陳杰;豬背最長肌肌纖維類型的發(fā)育性變化及其品種和性別特點[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2005年01期

本文編號：2706605