【摘要】：禽多瘤病(Avian polyomavirus disease),又稱鸚鵡幼雛病(Budgerigar Fledgling Disease,BFD),是一種由禽多瘤病毒(Avian Polyomavirus,APV)引起的急性傳染病,可感染多個(gè)品種的鳥,但主要引起鸚鵡幼雛發(fā)病,該病能引起鸚鵡幼雛呼吸困難,羽毛發(fā)育不全、生長遲緩、消瘦等癥狀并最終導(dǎo)致死亡。20世紀(jì)末傳入我國,曾在我國湖北、山東、福建等省份爆發(fā),給當(dāng)?shù)氐柠W鵡養(yǎng)殖企業(yè)帶來巨大損失。而到目前為止尚無針對(duì)禽多瘤病的有效疫苗及治療方法,因此,開展對(duì)APV的相關(guān)研究有著重要意義。本實(shí)驗(yàn)從疑似禽多瘤病發(fā)病鸚鵡的肝臟中分離到一株病毒,基因序列分析和動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果表明分離的病毒為禽多瘤病毒。試驗(yàn)建立了一種SYBR Green熒光定量PCR(qPCR)方法以期能夠用于禽多瘤病的臨床診斷。通過建立的熒光定量PCR方法對(duì)APV在鸚鵡胚成纖維細(xì)胞上的增殖情況進(jìn)行了研究,繪制了病毒增殖曲線。具體試驗(yàn)結(jié)果如下:1.試驗(yàn)采集了陜西臨潼地區(qū)的疑似禽多瘤病毒感染的病料,并用15日胚齡的健康鸚鵡胚制備了鸚鵡胚成纖維(BEF)原代細(xì)胞,通過將病料懸液接種到BEF細(xì)胞分離到了一株病毒,對(duì)分離病毒的VP1基因進(jìn)行序列分析,發(fā)現(xiàn)該病毒與NCBI上公布的11株來自世界各地的禽多瘤病毒核苷酸、氨基酸序列同源性達(dá)99%以上,其中與我國山東、日本的分離株的同源性達(dá)100%。將分離的病毒接種健康的鸚鵡幼雛,其發(fā)病癥狀、病理變化與禽多瘤病的相似,從而證實(shí)分離的病毒為禽多瘤病毒。2.試驗(yàn)構(gòu)建了209 bp的APV陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,通過熒光定量PCR測(cè)定經(jīng)過10倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=㧟3.255X+40.867,從而建立了一種SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。對(duì)該方法的多個(gè)方面進(jìn)行評(píng)估,試驗(yàn)結(jié)果表明,以4型禽腺病毒、H9N2型禽流感病毒、新城疫病毒作為模板時(shí),均未檢測(cè)到有效熒光信號(hào),僅禽多瘤病毒出現(xiàn)了特異性擴(kuò)增曲線;在靈敏性試驗(yàn)中,建立的熒光定量PCR方法相較于普通PCR其靈敏度高出100倍;在重復(fù)性試驗(yàn)中,組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)與組間重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)分別小于0.5%、1.5%。用該方法檢測(cè)臨床樣品,30份樣品檢出24份陽性,其檢出率高于普通PCR。綜上,試驗(yàn)所建立的禽多瘤病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好的特點(diǎn)。3.利用建立的熒光定量PCR測(cè)定了禽多瘤病毒在接種到鸚鵡胚成纖維細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)的病毒拷貝數(shù),并根據(jù)測(cè)定得出的數(shù)據(jù)繪制了病毒增殖曲線,發(fā)現(xiàn)該病毒接種鸚鵡胚成纖維細(xì)胞12 h后開始大量復(fù)制,接種后60 h達(dá)到最大病毒滴度。這為以后大規(guī)模增殖禽多瘤病毒提供了重要的參考。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2706551