【摘要】：為了研究大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella)中重金屬抗性基因流行情況及大腸桿菌、沙門氏菌中重金屬抗性基因與抗生素、季銨鹽(Quaternary ammonium compounds,QACs)消毒劑的耐藥表型和耐藥基因型的相關性,檢測了肉雞養(yǎng)殖場中分離的79株大腸桿菌、132株沙門氏菌,肉中分離的99株大腸桿菌、162株沙門氏菌中重金屬抗性基因,并根據(jù)檢測的基因型,測定了重金屬對菌株的最低抑菌濃度(Minimal inhibitory concentrations,MICs),分析了大腸桿菌、沙門氏菌中重金屬抗性基因與抗生素、消毒劑的耐藥表型及基因型相關性。選擇了一株對重金屬、抗生素及消毒劑同時具有抗性的大腸桿菌E308進行全基因測序,獲得了該菌株完整的基因組序列。在大腸桿菌、沙門氏菌中共檢測出9種重金屬抗性基因。在大腸桿菌中,基因zntA(表達對Zn的抗性)檢出率最高(P=77.0%),而zntB(表達對Zn的抗性)的檢出率最低(P=0.6%),zntA-rcnA基因組合在大腸桿菌中最高(P=11.8%),其次為arsB-zntA-rcnA(P=10.7%)、pcoR-zntA-rcnA(P=8.4%)。肉源大腸桿菌中arsB(表達對As的抗性)和merA(表達對Hg的抗性)的檢出率顯著高于雞場源大腸桿菌中的檢出率(p0.05)。重金屬對大腸桿菌的MICs范圍為≤12.5mg/L—1600 mg/L。其中,Hg~(2+)對大腸桿菌的MICs最小(≤12.5 mg/L),Zn~(2+)、Mn~(2+)對大腸桿菌MICs最高(1600 mg/L)。在沙門氏菌中,zntB抗性基因檢出率最高(P=87.1%),而zntA的檢出率最低(P=0.3%),基因型chrA-zntB在沙門氏菌中檢出率最高(P=19.4%),其次為zntB(P=14.6%)、pcoR-chrA-zntB(P=6.5%),27株沙門氏菌未檢出任何重金屬抗性基因(P=9.2%)。雞場源沙門氏菌中的arsB檢出率顯著高于肉源沙門氏菌(p0.05)。沙門氏菌對重金屬的MICs范圍為≤12.5 mg/L—1600 mg/L。沙門氏菌對Hg~(2+)的MICs最小(≤12.5 mg/L),而沙門氏菌對Cu~(2+)、Zn~(2+)以及Mn~(2+)的MICs最高(1600 mg/L)。在大腸桿菌中,重金屬抗性基因arsB與抗生素耐藥性存在相關性(p0.05),但未發(fā)現(xiàn)重金屬抗性基因和抗生素耐藥基因存在相關性。重金屬抗性基因arsB和zntA與苯扎氯銨(Benzalkonium chloride,BC)耐藥性存在顯著相關性(p0.01),重金屬抗性基因arsB和pcoR與十六烷基氯化吡啶(Cetylpyridinium chloride,CPC)耐藥性存在顯著相關性(p0.01)。重金屬抗性基因arsB、merA、pcoR(表達對Cu的抗性)、zntA、chrA(表達對Cr的抗性)與消毒劑耐藥基因存在顯著相關性(p0.05)。在沙門氏菌中,pcoR和pcoC(表達對Cu的抗性)與抗生素耐藥性存在相關性(p0.05),重金屬抗性基因均與β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、磺胺類、喹諾酮類以及氨基糖苷類抗生素耐藥基因存在相關性(p0.05)。在沙門氏菌中,arsB、chrA與消毒劑BC耐藥性具有相關性(p0.05)。重金屬抗性基因arsB、chrA與BC、CPC耐藥性具有相關性(p0.01),消毒劑耐藥基因qacEΔ1耐藥基因與arsB、pcoR和pcoA存在極顯著相關性(p0.001)。通過對大腸桿菌E308全基因組測得的序列進行組裝,最終獲得10個contigs,組裝的contigs總長度為5,350,144 bp。對基因組編碼基因預測,注釋得到5,155個基因,其注釋的基因總長為4,484,934 bp,占總序列的86.81%。通過組裝獲得一個長度為4,786,360 bp的環(huán)狀染色體序列,GC含量為50.76%,共預測得到4,658個基因。同時,組裝獲得四個環(huán)狀質(zhì)粒序列,分別命名為pLKSZ01,pLKSZ02,pLKSZ03及pLKSZ04,序列大小分別為111,721bp、113,645 bp、61,476 bp、92,978bp,質(zhì)粒類型分別為IncI1,IncF2,IncI2,p0111。通過對染色體基因序列進行比對,發(fā)現(xiàn)大量編碼抗生素、消毒劑、重金屬抗性基因以及大量可移動遺傳元件(Mobile genetic elements,MGEs)。其中,大多數(shù)屬于多重耐藥外排泵(Multidrug resistance efflux pump,MDR pump)系統(tǒng)。質(zhì)粒pLKSZ01序列包括了插入序列(Insertion sequences,ISs)、轉(zhuǎn)座子、接合轉(zhuǎn)移區(qū)域以及編碼大腸菌素1A、大腸菌素1A免疫蛋白、大腸菌素M免疫蛋白的基因。質(zhì)粒pLKSZ02的可變區(qū)包含了12個抗生素耐藥基因(blaCTX-M-55、oqxA、oqxB、fosA3、floR、tetA、tetR、strA、strB、sul2、aph(3’’)-II及blaTEM-1)以及大量的ISs。質(zhì)粒pLKSZ03包含了一個長的IV型菌毛(Type IV pilus,T4Ps)組裝系統(tǒng)、IV型分泌系統(tǒng)(Type IV secretion system,T4SSs)以及攜帶一個mcr-1基因(表達對多粘菌素的耐藥性)。質(zhì)粒pLKSZ04攜帶了8個抗生素耐藥基因、1個消毒劑耐藥基因以及1個重金屬Cr抗性基因(blaTEM-1,dfrA1,aadA2,qacEΔ1,sul1,chrA,mphA,mphR,tetR,tetA)。結果表明,重金屬抗性基因在大腸桿菌及沙門氏菌中普遍存在,大腸桿菌及沙門氏菌中重金屬抗性基因與抗生素耐藥性、消毒劑耐藥性存在相關性。在大腸桿菌的染色體上存在著大量的重金屬抗性基因以及消毒劑、抗生素耐藥基因,可能使大腸桿菌同時產(chǎn)生對重金屬、消毒劑、抗生素抗性。質(zhì)粒上攜帶著大量的抗生素耐藥基因,部分耐藥基因還能夠介導對消毒劑的耐藥性,同時對鉻(Cr)表達抗性的基因也有發(fā)現(xiàn),表明細菌對三者的抗性基因可能會在細菌之間進行傳播,導致細菌對重金屬、消毒劑和抗生素的共同耐藥。因此,加強畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中重金屬的管理,對控制重金屬、抗生素、消毒劑共同耐藥菌株的出現(xiàn)以及傳播有重要意義。
【圖文】：

33圖 3-1 大腸桿菌 E308 染色體基因組Figure 3-1 The chromosome genome of E. coli E308注：從外圈至內(nèi)圈，1、2 圈為編碼基因，3、4 圈為 eggNOG，4、5 圈為 KEGG，7、8 圈為GO，9、10 圈為 ncRNA，，11、12 圈為基因組 GC 含量，13、14 圈為基因組 GC skew 值分布

圖 3-3 質(zhì)粒 pLKSZ01 基因組Figure 3-3 The genome of plasmid pLKSZ01注：最外圈是質(zhì)粒上基因名或編碼蛋白類型，由外到里，分別是 COG 功能注釋分類基因、基因組序列位置坐標、基因組 GC 含量、基因組 GC skew 值分布。通過 BLASTN 比對表明，pLKSZ01 序列大約 84kb 序列和其它 IncI1 存在高度相關性（>95%），比如 p931IncI1（CP016387）、pTF2（KJ563250）、pTFH18（KM052220）以及 pC23-89 （KJ484639 ） 。在質(zhì)粒 pTF2、pTFH18以及 pC23-89 攜帶 bla-TEM 抗生素耐藥基因，而質(zhì)粒 pLKSZ01 沒有攜帶抗生素耐藥基因（圖 3-4）。
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S852.61

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本文編號：2704563