【摘要】：馬爾堡出血熱(MHF)是由馬爾堡病毒(MARV)引起的一種急性、烈性出血性人獸共患傳染病,目前尚無有效的疫苗和治療藥物。此外,由于MARV屬于生物安全四級(jí)病原體,進(jìn)一步阻礙了其傳統(tǒng)疫苗的研發(fā)。因此,研制安全、有效的新型疫苗對(duì)于應(yīng)對(duì)MHF的暴發(fā)流行和可能的生物恐怖襲擊均具有重要意義。病毒樣顆粒(VLPs)不含病毒核酸,無感染或復(fù)制能力,安全性高,形態(tài)結(jié)構(gòu)與天然病毒相似,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答反應(yīng),是當(dāng)前基因工程疫苗研究的熱點(diǎn)�；赩LP制備的乙型肝炎病毒(HBV)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)等多種新型疫苗均已成功上市。近年來,隨著研究的深入,病毒載體疫苗在烈性傳染病的防控中發(fā)揮著重要作用�？袢〔《�(RABV)作為疫苗載體具有基因組簡單、可穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白、允許插入多個(gè)大片段的外源基因且并不影響病毒自身復(fù)制、病毒基因組不會(huì)整合到宿主基因組等優(yōu)點(diǎn)。本論文利用昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Bac-to-Bac/IC)構(gòu)建并制備MARV VLPs,同時(shí)以狂犬病病毒SRV9株為載體,構(gòu)建表達(dá)MARV GP的重組狂犬病病毒,分別以小鼠、馬和非人靈長類等動(dòng)物評(píng)價(jià)其安全性和免疫原性,為研制安全、高效的MARV新型疫苗奠定基礎(chǔ)。利用昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)MARV糖蛋白(GP)和基質(zhì)蛋白(VP40)的重組桿狀病毒,基因組PCR、間接免疫熒光和Western Blot等方法鑒定結(jié)果表明:拯救的重組桿狀病毒可成功表達(dá)MARV GP和VP40蛋白。將獲得的重組桿狀病毒感染Sf9昆蟲細(xì)胞成功獲得了MARV VLPs,透射電鏡觀察表明:VLPs與MARV天然結(jié)構(gòu)相似,具有典型的絲狀結(jié)構(gòu),大小約為600-1000nm。利用超濾濃縮、蔗糖密度梯度離心等方法純化MARV VLPs,輔以(單獨(dú)或聯(lián)合使用)佐劑(茯苓多糖[PCP-II]、聚肌胞苷[PloyI/C]和鋁膠[Alum])制備免疫原,以小鼠和猴評(píng)價(jià)其免疫效果。小鼠試驗(yàn)結(jié)果表明:MARV VLPs成功誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答。3種免疫佐劑中PCP-II的效果明顯優(yōu)于其他組,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生顯著高的抗MARV抗體、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子分泌。猴試驗(yàn)結(jié)果顯示:MARV VLPs免疫恒河猴后可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗MARV抗體,ELISA抗體效價(jià)可達(dá)1:1280,病毒中和抗體效價(jià)可達(dá)1:320。MARV VLPs免疫組恒河猴的外周血淋巴細(xì)胞(PBMCs)可分泌顯著增多的IFN-γTh1型細(xì)胞因子和IL-4 Th2型細(xì)胞因子。以上結(jié)果表明,MARV VLPs聯(lián)合PCP-II佐劑在對(duì)小鼠和恒河猴具有良好的免疫效果,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答與細(xì)胞免疫應(yīng)答�？寡瀵煼ㄊ侵委煵《竞图�(xì)菌等感染的快速、經(jīng)濟(jì)和有效手段,將純化的MARV VLP輔以佐劑免疫健康馬匹,成功制備了馬抗MARV高免血清和精制免疫球蛋白F(ab')_2。馬抗MARV高免血清的ELISA抗體效價(jià)可達(dá)1:20480,中和抗體效價(jià)可達(dá)1:640;馬抗MARV IgG和精制免疫球蛋白F(ab')_2對(duì)MARV假病毒的半數(shù)效應(yīng)濃度(EC_(50))分別為0.316 mg/mL和10 mg/mL�；诒緦�(shí)驗(yàn)室建立的狂犬病病毒SRV9株反向遺傳操作平臺(tái),將MARV的G基因插入狂犬病病毒SRV9株的P-M基因之間,成功拯救獲得了表達(dá)MARV G蛋白的重組狂犬病病毒rSRV9-MGP。直接免疫熒光和Western-blot鑒定結(jié)果表明:重組病毒rSRV9-MGP可成功表達(dá)MARV G蛋白。rSRV9-MGP可在BSR細(xì)胞上高效穩(wěn)定復(fù)制,病毒滴度最高可達(dá)10~8 FFU/mL,且MARV G基因的插入不影響重組狂犬病病毒rSRV9-MGP的復(fù)制和生長。與母本毒株rSRV9相比,重組狂犬病病毒rSRV9-MGP對(duì)小鼠的致病性未增強(qiáng)。為評(píng)價(jià)重組病毒的免疫原性,將母本病毒rSRV9和重組病毒rSRV9-MGP滅活后,單獨(dú)免疫或混合佐劑免疫成年小鼠,結(jié)果表明:重組病毒rSRV9-MGP可同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗RABV和MARV的中和抗體;PCP-II佐劑組小鼠的特異性中和抗體水平和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)均優(yōu)于其他組。綜上所述,本研究制備的MARV VLPs和表達(dá)MARV GP重組狂犬病病毒可成功刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,為進(jìn)一步研制針對(duì)MARV的新型疫苗提供了技術(shù)支持和物質(zhì)儲(chǔ)備。
【圖文】：

爾堡病毒分類及形態(tài)結(jié)構(gòu)RV 為單股 RNA 病毒，只有單一種屬，以前稱為維多利亞湖馬爾堡下觀察 MARV 顆粒呈長絲狀，有時(shí)卷曲，直徑大小為 75～80 n1400 nm（圖 1）。MARV 基因組長約 19 kb，編碼糖蛋白（GP）40）、VP24、NP、VP35、VP30 和 L 7 種病毒結(jié)構(gòu)蛋白。MAR胞原代細(xì)胞、雞胚成纖維原代細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞系 (Hela cell)胞(Vero cell)和幼地鼠腎異倍體細(xì)胞等多種組織細(xì)胞中培養(yǎng)�；到y(tǒng)發(fā)育分析表明，該物種的已知成員至少可以分為五種不同的密切相關(guān)，核苷酸序列差異僅為 7％，，而第五種譜系不同，核苷]。由于所有分離株之間的基因組差異低于 30％，又將五種不同 M劃分為兩種譜系。

圖 2 馬爾堡病毒結(jié)構(gòu)蛋白和基因組示意圖Fig 2 Schematic representation of marburg virus structural protein and genome1967 年，歐洲首次報(bào)道病毒性疾病，通過電子顯微鏡觀察，將其確定致命性病原體。病毒顆粒的異常絲狀結(jié)構(gòu)混淆了人們的判斷，甚至部分人種疾病的致病因素可能與螺旋形鉤端螺旋體有關(guān)[4]。另一部分人認(rèn)為，觀顆粒形態(tài)與彈狀病毒形態(tài)相關(guān)，并將新發(fā)現(xiàn)的病原體以地名命名，RV[5]。MARV 粒子是多形性的顆粒，呈現(xiàn)為棒狀、環(huán)狀、彎曲、六形或構(gòu)。純化后病毒顆粒經(jīng)低溫電泳分析顯示，Vero 細(xì)胞培養(yǎng)的病毒顆粒約 絲狀，37％為六字形，33％為圓形[6]。同時(shí)，研究也揭示了病毒顆粒平均 892 nm，平均直徑為 91nm，與以往的常規(guī) EM 研究結(jié)果差異較大。常規(guī)究顯示，MARV 顆粒直徑均勻?yàn)?80 nm，而平均顆粒長度為 790 nm[7, 8]。異可能是由于冷凍電鏡和常規(guī)電鏡之間的實(shí)驗(yàn)差異造成的[6]。值得注意的
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2704597