【摘要】：兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)為杯狀病毒科的重要成員,對(duì)多個(gè)品種兔均具有高度致病性和致死性。長(zhǎng)期以來(lái),由于缺乏穩(wěn)定的體外培養(yǎng)細(xì)胞系,RHDV生命過(guò)程中的許多分子機(jī)制尚不清楚。核仁素(Nucleolin,NCL)為宿主重要的多功能蛋白,我們前期的研究發(fā)現(xiàn)NCL可能參與RHDV的生命過(guò)程。鑒于此,本論文綜合利用分子生物學(xué)方法和基因工程技術(shù),系統(tǒng)研究了NCL在RHDV感染和復(fù)制中的作用及其分子機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容如下:(1)利用抑制劑及siRNA干擾技術(shù),我們發(fā)現(xiàn)NCL在RHDV內(nèi)化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然后,我們證明了NCL通過(guò)其N端結(jié)構(gòu)域與RHDV衣殼蛋白(VP60)的保守區(qū)域DVN肽(~(472)Asp-Val-Asn~(474))段特異性的相互作用。隨后,利用人工合成的DVN肽阻斷VP60與NCL之間的結(jié)合后,病毒的內(nèi)化效率明顯降低。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)NCL與網(wǎng)格蛋白輕鏈(Clathrin light chain A,CLTA)特異性結(jié)合,進(jìn)而參與網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DVN多肽可以保護(hù)大部分實(shí)驗(yàn)兔免受RHDV感染。上述研究結(jié)果表明NCL通過(guò)網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞作用介導(dǎo)RHDV的內(nèi)化過(guò)程。(2)利用RHDV復(fù)制子系統(tǒng)和蛋白親和純化技術(shù),我們成功分離并鑒定了RHDV復(fù)制復(fù)合物(RC)的主要成分,發(fā)現(xiàn)NCL與病毒蛋白(RdRp、p16和p23)參與病毒RC的形成。隨后,我們證明了RdRp與病毒其他非結(jié)構(gòu)蛋白不存在相互作用,而是通過(guò)NCL間接結(jié)合p16和p23病毒蛋白以及其他宿主蛋白,進(jìn)而形成RC。同時(shí),我們成功鑒定了RdRp、p16和p23與NCL相互作用的活性區(qū)域分別位于RdRp(第448-478位肽段)、p16(~(35)Cys-Ile-Arg-Ala~(38)肽段)和p23(第90-145位肽段)。此外,利用人工合成的RdRp多肽和p16多肽阻斷NCL與病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)合,我們發(fā)現(xiàn)RHDV的復(fù)制水平均顯著降低。上述研究結(jié)果表明,NCL在RHDV RC的形成過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的橋梁作用。(3)我們發(fā)現(xiàn)RHDV感染后宿主NCL的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高,而蛋白水平并無(wú)明顯變化。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)NCL通過(guò)與組蛋白去乙�；�2(Histone deacetylase 2,HDAC2)結(jié)合,發(fā)生去乙�；�,隨之被泛素化降解。我們還發(fā)現(xiàn)HDAC2對(duì)RHDV具有抗病毒作用,病毒的復(fù)制水平與HDAC2的活性呈負(fù)相關(guān)性。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)RHDV利用p16與HDAC2特異性結(jié)合降低HDAC2的去乙�；富钚�。以上結(jié)果表明,HDAC2通過(guò)誘使NCL去乙�；�,導(dǎo)致其被泛素化途徑降解,進(jìn)而抑制RHDV的復(fù)制,而RHDV則利用p16蛋白拮抗HDAC2的抗病毒作用。綜上所述,本論文首次發(fā)現(xiàn)RHDV通過(guò)劫持NCL完成入侵細(xì)胞的內(nèi)化過(guò)程。同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn)NCL在RHDV復(fù)制復(fù)合體的形成過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的橋梁作用。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)宿主蛋白HDAC2對(duì)RHDV具有抗病毒作用。上述研究成果使我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)了RHDV感染和復(fù)制的分子機(jī)制,為該病毒的防控提供了重要的理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第 章 引 2010 年開始在歐洲爆發(fā)并逐漸流行的新型兔出血癥病毒（RHDV2）屬于 GI.2 基因型all-Recule et al., 2011)。GI.1 和 GI.2 兩個(gè)基因型的 RHDV 沒有交叉免疫原性，因此在歐洲 RHD經(jīng)逐漸取代經(jīng)典 RHDV 成為優(yōu)勢(shì)流行毒株(譚永貴等, 2016)。

國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第 章 引病毒對(duì)理化因素具有較強(qiáng)的抵抗力，杜念興等(杜念興等, 1986)發(fā)現(xiàn)，RHDV 對(duì)熱（60℃in），對(duì)酸（pH 3.0）穩(wěn)定，能耐乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑的處理，，對(duì) 1M 的氯化鎂等化學(xué)試具有較強(qiáng)的抵抗力。20%甲醛溶液作用 2.5 h，10%的漂白粉消毒液作用 2-3 h 以及 1% 氫消毒液作用 3-4 h 能夠完全殺滅該病毒，而生石灰和過(guò)氧乙酸類消毒液對(duì) RHDV 殺滅效果
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S858.291


本文編號(hào)：2704467