【摘要】：弓形蟲是專性胞內(nèi)寄生原蟲,臨床可以感染人及溫血?jiǎng)游?并造成嚴(yán)重的公共健康問題。盡管弓形蟲病對人和動(dòng)物具有較大的威脅,并且已經(jīng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,但臨床上的治療手段仍然是有限的,并且存在不能根治和副作用較大的問題。天然化合物作為巨大的化合物庫,是抗弓形蟲藥物新藥研發(fā)的重要資源。本試驗(yàn)選取了一系列具有抗癌和抗寄生蟲活性的中藥的主要活性單體進(jìn)行體外抗弓形蟲活性篩選,并在體內(nèi)和體外對篩選出的天然產(chǎn)物的藥效進(jìn)行系統(tǒng)性的評價(jià),初步探索其抗弓形蟲機(jī)理,為臨床治療與抗弓形蟲藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。首先采用MTT法,測定不同濃度下黃芩苷、漢黃芩苷、甘草苷、甘草查爾酮A、氫溴酸檳榔堿、川楝素、對葉百部堿、鴉膽子素D、綠原酸、L-扁桃酸和D-扁桃酸對HFF細(xì)胞的細(xì)胞毒性,找出對HFF細(xì)胞生存的最小抑制濃度(生存率95%)。并在最小抑制濃度下,進(jìn)行體外抗弓形蟲活性篩選,通過Giemsa染色觀察抗蟲效果。細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示:11種天然產(chǎn)物對HFF細(xì)胞生存最小抑制濃度分別為:黃芩苷200μg/mL,漢黃芩苷80μg/m L,甘草苷70μg/m L,甘草查爾酮A 10μg/m L,氫溴酸檳榔堿20μg/m L,川楝素5μg/m L,對葉百部堿40μg/m L,鴉膽子素D 1μg/m L,綠原酸400μg/m L,L-扁桃酸80μg/m L,D-扁桃酸80μg/m L。經(jīng)初步抗蟲活性篩選試驗(yàn)顯示:11種天然產(chǎn)物中,甘草查爾酮A具有明顯的抗弓形蟲增殖的作用。為了確定甘草查爾酮A在培養(yǎng)基中的保留時(shí)間,采用高效液相色譜法對培養(yǎng)基中甘草查爾酮A濃度進(jìn)行測定,并繪制藥時(shí)曲線。結(jié)果表明,甘草查爾酮A在0.01-2.0μg/m L的濃度范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,且此方法的專屬性好,回收率較高,精密度較好。測定甘草查爾酮A在培養(yǎng)基中的濃度隨著時(shí)間逐漸下降,且在48 h時(shí)三個(gè)濃度(1.2μg/m L、1.0μg/m L、0.5μg/m L)的甘草查爾酮A均檢測不到。為考察甘草查爾酮A對弓形蟲速殖子入侵HFF細(xì)胞的影響。培養(yǎng)基中加入甘草查爾酮A后加入弓形蟲速殖子孵育2 h,棄去藥物培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用Giemsa染色觀察甘草查爾酮A對弓形蟲入侵宿主細(xì)胞的影響,試驗(yàn)結(jié)果顯示甘草查爾酮的濃度高于1μg/m L時(shí),可以完全抑制蟲體的入侵,并呈劑量依賴。為確定甘草查爾酮A的抗蟲體增殖效果和準(zhǔn)確測定對蟲體增殖的IC_(50),首先,建立了用熒光定量PCR評價(jià)蟲體荷載量的方法,并采用此方法對不同濃度的甘草查爾酮A作用下的蟲體荷載量進(jìn)行測定,計(jì)算甘草查爾酮A對弓形蟲的IC_(50)。同時(shí),用Giemsa染色法觀察不同濃度的甘草查爾酮A對弓形蟲增殖的影響。結(jié)果顯示,建立的評價(jià)蟲體荷載量的熒光定量PCR的方法精密度和回收率的RSD值均小于5。Giemsa染色表明:隨著甘草查爾酮A的濃度的升高,處理孔內(nèi)的包囊數(shù),速殖子數(shù),和納蟲囊泡內(nèi)的平均蟲體數(shù)均降低呈劑量依賴。用熒光定量PCR測定在各個(gè)甘草查爾酮A濃度下的蟲體荷載量,結(jié)果與Giemsa染色結(jié)果一致,并且通過計(jì)算得出,甘草查爾酮A對弓形蟲速殖子的半數(shù)抑制濃度IC_(50)值為0.848μg/mL。為探究甘草查爾酮A抑制蟲體增殖的機(jī)制,采用掃描電鏡和透射電鏡觀察甘草查爾酮A對弓形蟲的超微結(jié)構(gòu)的影響,隨后采用尼羅紅染色,用激光共聚焦顯微鏡觀察脂質(zhì)富集,并用流式細(xì)胞儀對熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定。掃描電鏡顯示:不同濃度處理后弓形蟲速殖子變小變圓,表面出現(xiàn)凹陷,并且濃度越大越明顯。透射電鏡結(jié)果顯示:同一濃度處理下,速殖子內(nèi)部出現(xiàn)脂體,并且隨著時(shí)間的延長脂體逐漸增多,各個(gè)細(xì)胞器的膜結(jié)構(gòu)消失,最終蟲體死亡。尼羅紅染色證明了這一現(xiàn)象,可以觀察到中性脂類在蟲體內(nèi)蓄積的情況,并隨著時(shí)間的延長積累加劇。表明甘草查爾酮A是通過干擾脂代謝而引起蟲體死亡。在體內(nèi),首先確定口服和腹腔注射的最大安全給藥劑量和給藥次數(shù)。建立體內(nèi)弓形蟲急性感染模型,采用口服和腹腔注射兩種方式對不同濃度甘草查爾酮A的體內(nèi)抗蟲效果進(jìn)行評價(jià)�？诜什莶闋柾狝最大劑量達(dá)到1000 mg/kg沒有出現(xiàn)不良反應(yīng),在腹腔注射時(shí)劑量達(dá)到為386 mg/kg.bw時(shí),小鼠出現(xiàn)死亡。24 h內(nèi)腹腔注射3次,給藥在達(dá)到1000mg/m L時(shí)未發(fā)現(xiàn)死亡現(xiàn)象。在小鼠急性感染模型治療實(shí)驗(yàn)中,低劑量腹腔注射組存活率為80%,中劑量腹腔注射組存活率為90%,高劑量腹腔注射組的存活率為100%,口服各劑量組沒有改變死亡的結(jié)局,但平均存活時(shí)間均有延長,但各劑量組之間沒有顯著差異。安全性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在此給藥方式下各組小鼠均無死亡,采取各器官,切片做HE染色均無發(fā)現(xiàn)異常。終上所述:甘草查爾酮A可以抑制弓形蟲速殖子的入侵和復(fù)制,提高感染小鼠的生存率,超微結(jié)構(gòu)觀察顯示,甘草查爾酮A的抗蟲機(jī)制與脂代謝相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表明甘草查爾酮A是潛在的抗弓形蟲化合物,有望開發(fā)成為抗弓形蟲藥物。
【圖文】：

進(jìn)行分裂生殖。速殖子（Tachyzoite）寬 2-4μm，長 4-8μm，是弓形蟲快速繁殖階段的生命形態(tài)（如圖1-1 F 所示）。該時(shí)期蟲體一端尖銳，，一端鈍圓，中央膨大呈新月形或弓形。速殖子可以主動(dòng)入侵進(jìn)入所有的有核細(xì)胞，在胞質(zhì)內(nèi)形成納蟲囊泡（ParasitophorousVacuole,PV）。速殖子的增值，將會(huì)使被感染的宿主細(xì)胞脹破，釋放出的速殖子經(jīng)血液流動(dòng)散播至全身，并感染多種組織，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、眼、骨骼肌、心肌和胎盤等。溢出的蟲體侵入鄰近細(xì)胞，引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)和組織損傷，因此弓形蟲病的大部分臨床癥狀也都由此而來。當(dāng)速殖子處于抗弓形蟲藥物或宿主的免疫反應(yīng)的狀態(tài)下時(shí)，會(huì)形成包囊（Cyst or Tissue Cyst）并轉(zhuǎn)化為緩殖子。

圖 1-2 弓形蟲的生命周期和弓形蟲病的臨床表現(xiàn)（Montoya, 2004）Fig. 1-2 Life cycle of T gondii and clinical manifestations of toxoplasmosis孕婦在懷孕期間初次感染弓形蟲后，寄生蟲通過胎盤進(jìn)入胎兒循環(huán)引起胎兒先天感染。先天性弓形蟲病的患病率在萬分之一到萬分之十之間[58,59]。孕婦在懷孕前已經(jīng)感染對胎兒
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S853.7

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本文編號：2704273