【摘要】：在反芻動(dòng)物中,短鏈脂肪酸(Short chain fatty acid,SCFAs)能夠?yàn)槟膛：途d羊提供約70%的能量來(lái)源,它是由瘤胃微生物快速發(fā)酵日糧中碳水化合物產(chǎn)生的,約占總SCFAs的95%。添加高精料能夠快速被瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)生高濃度的SCFAs并提供能量和提高奶牛的產(chǎn)奶量,然而,也會(huì)引起快速的炎癥反應(yīng)。之前的研究已經(jīng)報(bào)道,SCFAs能夠調(diào)節(jié)小鼠結(jié)腸上皮的炎癥反應(yīng)。此外,G-蛋白偶聯(lián)受體41(G protein-coupled receptor 41,GPR41)是SCFAs的受體。我們推測(cè)作為反芻動(dòng)物主要能量來(lái)源的SCFAs是否能夠通過(guò)GPR41來(lái)調(diào)控奶牛瘤胃上皮炎癥反應(yīng)有待進(jìn)一步研究。在研究GPR41是如何調(diào)控奶牛瘤胃上皮炎癥機(jī)制之前,我們必須獲得穩(wěn)定連續(xù)傳代的奶牛瘤胃上皮細(xì)胞系(Bovine rumen epithelial cells,BRECs)。然而,永生化的BRECs系還未被建立。因此,本研究目的是首先建立永生化的BRECs系,其次深入探討SCFAs是否能通過(guò)GPR41調(diào)控BRECs的炎癥反應(yīng),為研究GPR41在BRECs炎癥反應(yīng)潛在的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。試驗(yàn)一、永生化奶牛瘤胃上皮細(xì)胞系建立在反芻動(dòng)物中,奶牛瘤胃上皮細(xì)胞對(duì)于短鏈脂肪酸的吸收和代謝扮演至關(guān)重要的作用。一個(gè)連續(xù)傳代的BRECs對(duì)于通過(guò)CRISPR/Cas 9系統(tǒng)研究基因的功能是一個(gè)有用的細(xì)胞素材。然而,永生化的BRECs并未被報(bào)道。因此,本試驗(yàn)?zāi)康氖菫榱私⒁粋�(gè)永生化的BRECs。瘤胃上皮組織是來(lái)自于3頭青年牛,并通過(guò)一系列的酶消化獲得原代BRECs。通過(guò)SV40T抗原整合至BRECs基因組中使BRECs永生化。永生化BRECs保持典型的上皮型和鵝卵石形態(tài)并在4天培養(yǎng)之后,細(xì)胞密度能夠達(dá)到100%。永生化BRECs能夠快速地增殖并未顯示任何的衰老信號(hào)。同時(shí),那些細(xì)胞具有表達(dá)細(xì)胞角蛋白18、monocarboxylate transporter 1(MCT1)、MCT4、Na+/H+ exchanger 1(NHE1)、NHE2、NHE3 和 GPR41 的特征。與 pH 7.4相比,pH 5.5能夠顯著增加BRECs對(duì)丙酸的吸收。綜上所述,我們已經(jīng)建立了永生化的BRECs,這個(gè)細(xì)胞系能夠進(jìn)一步研究SCFAs的吸收、代謝、細(xì)胞增殖和分化相關(guān)功能性基因的分子機(jī)制。試驗(yàn)二、SCFAs對(duì)相關(guān)短鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和GPR41表達(dá)影響本試驗(yàn)旨在研究不同pH和SCFAs對(duì)相關(guān)SCFAs轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和GPR41表達(dá)影響。試驗(yàn)分為6個(gè)組:培養(yǎng)基pH 6.2、pH 6.8和pH 7.4分別細(xì)胞培養(yǎng)24 h;pH 6.2培養(yǎng)基含20 mM SCFAs、pH 6.8培養(yǎng)基含20 mM SCFAs和pH 7.4培養(yǎng)基含20 mM SCFAs各自細(xì)胞培養(yǎng)24 h,每組3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)24 h之后,細(xì)胞被收集提取細(xì)胞總RNA。結(jié)果表明,添加SCFAs條件下,pH 6.2、pH 6.8和pH 7.4之間的MCT1表達(dá)量差異不顯著(;p0.05)。pH 6.8且添加SCFAs條件下,MCT1的表達(dá)量顯著高于缺乏SCFAs pH 6.8和pH 7.4試驗(yàn)組(p0.05)。添加SCFAs條件下,pH 6.2的MCT4的表達(dá)量顯著高于pH 6.8和pH 7.4(p0.01)。添加SCFAs條件下,MCT4的表達(dá)量顯著高于缺乏SCFAs(p0.01)。添加SCFAs條件下,NHE1、NHE2和NHE3表達(dá)量顯著高于缺乏SCFAs時(shí)的表達(dá)量(p0.01)。隨著pH的降低,NHE1、NHE2和NHE3的表達(dá)量逐漸上調(diào)。缺乏SCFAs條件下,GPR41不能夠表達(dá)。添加SCFAs之后,能夠顯著激活GPR41的表達(dá)。與pH 7.4相比,pH 6.8能夠顯著上調(diào)GPR41的表達(dá)量(p0.05)。結(jié)果證明,低pH和SCFAs能夠顯著加強(qiáng)相關(guān)SCFAs轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和GPR41的mRNA表達(dá)量。試驗(yàn)三、轉(zhuǎn)錄組分析SCFAs誘導(dǎo)BRECs的mRNA的差異基因和差異信號(hào)通路本試驗(yàn)旨在利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)來(lái)研究SCFAs刺激BRECs后mRNA的差異基因和差異信號(hào)通路。試驗(yàn)分為2個(gè)組:培養(yǎng)基pH 6.2細(xì)胞培養(yǎng)24 h;pH 6.2培養(yǎng)基含20 mM SCFAs細(xì)胞培養(yǎng)24 h,每組3個(gè)重復(fù)。結(jié)果表明,添加SCFAs誘導(dǎo)BRECs之后4011個(gè)基因被顯著上調(diào),1431個(gè)基因被顯著下調(diào)(p0.05)。通過(guò)SCFAs誘導(dǎo)BRECs之后,促炎癥因子IL-1β 和 TNF-α 顯著上調(diào)。此外,CCL20、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL8 和 CXCL14趨化因子表達(dá)水平被顯著上調(diào)(p0.01)。鈣離子信號(hào)通路中關(guān)鍵分子PLCβ2和IP3R1被顯著上調(diào)(p0.01)。此外,SCFAs能夠顯著激活BRECs的MAPK信號(hào)通路、Cytokine-cytokine receptor interaction信號(hào)通路和Ca2+信號(hào)通路。結(jié)果證明,SCFAs能夠激活BRECs炎癥反應(yīng)和Ca2+信號(hào)通路。試驗(yàn)四、SCFAs對(duì)BRECs的促炎癥因子、趨化因子和緊密連接蛋白表達(dá)的影響本試驗(yàn)旨在通過(guò)qRT-PCR和Western blotting來(lái)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組的相關(guān)結(jié)果以及不同濃度的SCFAs和不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)BRECs的促炎癥因子、趨化因子和緊密連接蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明,qRT-PCR的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組的試驗(yàn)結(jié)果一致,SCFAs能夠促進(jìn)BRECs的促炎癥因子、趨化因子和Ca2+信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)。此外,SCFAs誘導(dǎo)BRECs炎癥反應(yīng)涉及p-Erk1/2 MAPK信號(hào)分子的激活,但不是涉及NF-κB信號(hào)通路。高濃度的SCFAs能夠加強(qiáng)促炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達(dá),但下調(diào)CXCL2、CXCL3、CXCL5和CXCL8趨化因子和緊密連接蛋白Claudin-1和ZO-1的表達(dá)量。培養(yǎng)至72 h時(shí),促炎癥因子IL-1β顯著高于 24 h 和 48 h(p0.05)。與 48 h 相比,培養(yǎng)至 72 h,Occludin、Claudin-1 和 ZO-1的表達(dá)量被下調(diào),但差異不顯著。這些結(jié)果提示,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),能夠引起B(yǎng)RECs促炎癥反應(yīng)和抑制緊密連接蛋白的表達(dá)。這個(gè)結(jié)果證明,高濃度的SCFAs引起B(yǎng)RECs的促炎癥反應(yīng)和破壞BRECs的免疫趨化和免疫屏障功能。試驗(yàn)五、GPR41調(diào)控BRECs炎癥因子、趨化因子和緊密連接蛋白的表達(dá)本試驗(yàn)旨在通過(guò)CRISPR/Cas 9系統(tǒng)敲除GPR41進(jìn)一步深入研究GPR41是否能夠調(diào)控BRECs的炎癥因子、趨化因子、緊密連接蛋白的表達(dá)和Ca2+信號(hào)通路。試驗(yàn)分為3個(gè)組:培養(yǎng)基+BRECs、含20 mM SCFAs培養(yǎng)基+BRECs和含20 mM SCFAs培養(yǎng)基+敲除GPR41基因的BRECs,各自培養(yǎng)細(xì)胞24h,每組3個(gè)重復(fù)。結(jié)果表明,在gRNA1和gRNA3共同切割靶位點(diǎn)的作用下,GPR41基因的第一個(gè)外顯子被刪除142bp。與野生型相比,敲除GPR41之后,GPR41的表達(dá)量顯著下調(diào)了 2.7倍(p0.05)。與野生型相比,敲除GPR41之后,促炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)量被顯著上調(diào)(p0.05)。然而,CCL20、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL8和CXCL14趨化因子以及緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達(dá)量被下調(diào)(p0.05)。此外,涉及Ca2+信號(hào)通路關(guān)鍵分子IP3R1的mRNA表達(dá)量被顯著下調(diào)(p0.05)。這個(gè)結(jié)果證明,GPR41下調(diào)引起B(yǎng)RECs的促炎癥反應(yīng),但減少BRECs的趨化因子和免疫屏障相關(guān)基因的表達(dá)量。
【圖文】：

圖１－１邋ＳＶ４０Ｔ免疫印跡和永生化奶牛瘤胃上皮細(xì)胞的形態(tài)特征。（Ａ）邋ＳＶ４０Ｔ免疫印跡。逡逑ＢＲＥＣｓ：未感染的奶牛瘤胃上皮細(xì)胞。２９３Ｔ：作為陽(yáng)性對(duì)照，表達(dá)ＳＶ４０Ｔ抗原。ＢＲＥＣｓ－ＳＶ４０Ｔ：逡逑導(dǎo)入了邋ＳＶ４０Ｔ基因。（Ｂ）培養(yǎng)１天后，奶牛瘤胃上皮細(xì)胞形態(tài)。（Ｃ）培養(yǎng)２天后，，奶逡逑牛瘤胃上皮細(xì)胞形態(tài)。（Ｄ）培養(yǎng)３天后，奶牛瘤胃上皮細(xì)胞形態(tài)。（Ｅ）培養(yǎng)４天后，奶逡逑

表達(dá)細(xì)胞角蛋白１８，然而，２９３Ｔ和永生化的奶牛瘤胃上皮細(xì)胞能夠表達(dá)細(xì)胞角蛋白１８邋（圖逡逑１－２Ａ）。此外，免疫熒光的結(jié)果也證明，在整個(gè)視野下，未添加細(xì)胞角蛋白１８食抗條件逡逑下，奶牛瘤胃上皮細(xì)胞未發(fā)出綠色熒光（圖１－２Ｂ）。然而，添加細(xì)胞角蛋白１８邋—抗條件逡逑下，奶牛瘤胃上皮細(xì)胞能夠顯示出綠色熒光（圖１－２
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S858.23

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 余燕;李元曉;李旺;丁軻;李東平;王小芳;曹志軍;李勝利;;成年牛瘤胃上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法研究[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2016年05期

2 劉思樂(lè);康勁翮;譚支良;王征;;不同培養(yǎng)方法對(duì)山羊瘤胃上皮細(xì)胞生長(zhǎng)及角蛋白18表達(dá)量的影響[J];動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào);2016年04期

3 ;Butyrate-induced GPR41 Activation Inhibits Histone Acetylation and Cell Growth[J];遺傳學(xué)報(bào);2012年08期

4 孫志洪;張慶麗;賀志雄;韓雪峰;譚支良;張恩平;湯少勛;周傳社;王敏;;山羊瘤胃上皮細(xì)胞和空腸黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)研究[J];動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào);2010年03期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 潘小平;永生化豬肝細(xì)胞系的建立及其鑒定[D];浙江大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2703752