【摘要】：綿羊瘤胃作為反芻動物的第一個胃,經(jīng)常會受到各種病原微生物的挑戰(zhàn)。綿羊瘤胃黏膜上皮在先天性免疫中發(fā)揮重要作用,并可以分泌一系列先天免疫分子來防止微生物的侵襲。防御素是一種由黏膜上皮產(chǎn)生并具有廣譜抗微生物活性的陽離子肽,被認為是抗生素的潛在替代品。本課題組先前的研究表明釀酒酵母全細胞壁能夠上調(diào)綿羊瘤胃上皮細胞(Ovine ruminal epithelial cells,ORECs)內(nèi) β-防御素-1(Sheepβ-defensin-1,SBD-1)的表達,為了進一步確定釀酒酵母細胞壁誘導SBD-1表達的有效成分,本研究選用來源于釀酒酵母細胞壁的β-葡聚糖刺激ORECs以觀察其對SBD-1表達的影響,并進一步研究此誘導過程可能涉及的信號通路。外植體培養(yǎng)具有在受控環(huán)境中保留與體內(nèi)相似的組織學特征等特點,因此外植體培養(yǎng)相對于細胞而言更接近于體內(nèi)環(huán)境。本研究探索了綿羊瘤胃外植體(Ovine ruminal explants,OREs)培養(yǎng)的可行性和最佳條件,并在此基礎上研究β-葡聚糖對OREs內(nèi)抗菌肽SBD-1、促炎細胞因子IL-6和抗炎細胞因子IL-10表達的影響。具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下:(1)用不同濃度(0、5、10、20、50和100 μg/mL)的β-葡聚糖刺激ORECs 8 h后,利用qPCR和ELISA方法檢測SBD-1的表達變化,從而篩選出誘導SBD-1表達最佳的β-葡聚糖濃度,而后用此濃度刺激ORECs不同時間(0、2、4、8、12和24 h),同樣采用qPCR和ELISA方法篩選出誘導SBD-1表達的最佳時間。結(jié)果顯示:10μg/mL的β-葡聚糖分別刺激ORECs 2和4 h時SBD-1 mRNA和蛋白表達最大。(2)采用Western blot、RT-PCR、免疫組化、免疫熒光、qPCR和ELISA方法檢測β-葡聚糖誘導SBD-1表達上調(diào)的信號通路。結(jié)果表明樹突狀細胞相關C型凝集素 1(Dendritic-cell-associated C-type lectin 1,Dectin-1)和脾臟酪氨酸激酶(Spleen tyrosine kinase,Syk)在綿羊瘤胃黏膜組織及ORECs內(nèi)表達,并且用siRNAs干擾或抑制劑抑制Dectin-1、Syk、TLR-2和MyD88表達后減弱了β-葡聚糖誘導的SBD-1表達。用β-葡聚糖處理ORECs導致p38、JNK、ERK1/2和NF-κB表達顯著增加,而用抑制劑抑制MAPK和NF-κB途徑顯著降低了 β-葡聚糖誘導SBD-1的表達,且NF-κB抑制劑效果最明顯。(3)培養(yǎng)OREs,并采用H.E染色、qPCR和免疫組化等方法檢測OREs的組織結(jié)構完整性及細胞活性。H.E染色結(jié)果顯示:不添加血清的培養(yǎng)基內(nèi)OREs組織結(jié)構更完整。qPCR和免疫組化結(jié)果顯示:培養(yǎng)24 h以內(nèi)的OREs E-cadherin的表達與未培養(yǎng)的組織差異不顯著,且存在CK-18和Ki-67的陽性信號。(4)將OREs與不同濃度(0、10、50、100、200和400 μg/mL)的β-葡聚糖共培養(yǎng)8 h后,采用qPCR和ELISA方法檢測SBD-1、IL-6和IL-10的表達變化,從而篩選出誘導SBD-1、IL-6和IL-10表達最佳的β-葡聚糖濃度,而后用此濃度刺激ORECs不同時間(0、2、4、8、12和24 h)后,同樣采用qPCR和ELISA方法篩選出誘導SBD-1、IL-6和IL-10表達的最佳時間。結(jié)果顯示:50 μg/mL的β-葡聚糖分別刺激OREs 2、8 和 12 h 時 SBD-1、IL-6 和 IL-10 的 mRNA 表達最高,100 pg/mL 的 β-葡聚糖刺激OREs 8 h時SBD-1蛋白表達達到峰值,而分別用50和200 μg/mL刺激OREs 12 h時IL-6和IL-10蛋白表達達到最大。本研究結(jié)果表明β-葡聚糖能夠提高ORECs內(nèi)SBD-1的表達,且該過程由Dectin-1-Syk/TLR-2-MyD88-MAPK/NF-κB信號通路共同介導產(chǎn)生,但可能主要通過Dectin-1-Syk/TLR-2-MyD88-NF-κB信號通路。此外,本研究還確定了 OREs體外培養(yǎng)的可行性和最佳條件,并證明β-葡聚糖可以激活OREs中SBD-1、IL-6和IL-10的分泌。
【圖文】：

ｗ。根據(jù)細胞位置、表達譜、半胱氨酸間隔和二硫化物（Ｓ－Ｓ）鍵連接性，脊椎動物逡逑防御素可以進一步細分為ａ－防御素、Ｐ－防御素和０－防御素（圖１－丨）。逡逑ｐ邐ａａｉｋｒｋ邐ａ，ｉｉ＾ｄｂｉ４邐ｔ逡逑人邐＾３７邐２邐３逡逑鼠邐？４９邐以邐＾邐－逡逑恒河猴邐ｙ邐６邐６邐ｊ逡逑圖１－１防御素的分類［１°］逡逑Ｆｉｇ．邋ｌ－ｌ邋Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ逡逑１．３邐（３邋＿防御素逡逑Ｐ－防御素是最大的脊椎動物防御素家族，最初是從牛的上皮細胞和嗜中性粒細胞逡逑中分離出來的ｍ］，隨后Ｐ－防御素被發(fā)現(xiàn)幾乎存在于所有脊椎動物中ｎ２］。Ｐ－防御素產(chǎn)生逡逑并儲存于上皮細胞、嗜中性粒細胞和吞噻細胞中。在病原體感染期間，儲存在顆粒體逡逑中的Ｐ－防御素會釋放到吞噬體或細胞外系統(tǒng)中，，構成體內(nèi)第一道防線，從而防御病原逡逑體入侵。逡逑１．３．邋１邋Ｐ－防御素的結(jié)構與分布逡逑Ｐ－防御素的基因由兩個外顯子組成，并聚集在４或５個基因組區(qū)域ｎ３］，其成熟肽逡逑一般含有３８？４２個氨基酸，其中６個保守的半胱氨酸組成３對二硫鍵分別為逡逑Ｃｙｓｌ－Ｃｙｓ５、Ｃｙｓ２－Ｃｙｓ４、Ｃｙｓ３－Ｃｙｓ６

先天和適應性防御反應（如分泌黏蛋白、防御素、三葉因子、免疫球蛋白Ａ逡逑（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ邋Ａ，邋ＩｇＡ）、Ｔｏｌｌ邋樣受體（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＴＬＲｓ）、細胞因子、逡逑腸相關淋巴組織和信號通路等）［４４＿？（圖１－２）。逡逑
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.2

【參考文獻】

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1 金鑫;張曼;范燕茹;王佩;楊銀鳳;;β-防御素在感染和炎癥過程中的作用[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2015年13期

2 李硯;楊銀鳳;;家畜體內(nèi)防御素多態(tài)性和表達的研究進展[J];中國畜牧獸醫(yī);2013年03期

3 趙遠;王永忠;;上皮鈣粘蛋白和β-連環(huán)蛋白的研究進展[J];江蘇醫(yī)藥;2011年13期

4 胡志德;黃元蘭;孫懿;陳孫孝;鄧安梅;仲人前;;熱滅活白念珠菌通過Dectin-1誘導外周血單個核細胞表達IL-12和IFN-γ[J];現(xiàn)代免疫學;2011年01期

本文編號：2703682