【摘要】：肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,SP)是一種主要定植于人體上呼吸道鼻咽部黏膜的革蘭氏陽性胞外菌,主要感染免疫力低下的老人及五歲以下的兒童,可引起人的腦膜炎、中耳炎、敗血癥等疾病,同時(shí)也是社區(qū)獲得性肺炎的主要病原。肺炎鏈球菌溶血素(Pneumolysin,PLY)作為該菌的主要毒力因子,在肺炎鏈球菌感染宿主、誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答中扮演著重要角色。肺炎鏈球菌感染可誘導(dǎo)宿主免疫細(xì)胞分泌IL-1家族、TNFα等細(xì)胞因子,這些細(xì)胞因子進(jìn)一步誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答,對(duì)宿主抗肺炎鏈球菌感染具有重要的保護(hù)性作用。促炎因子IL-1β在宿主抗肺炎鏈球菌感染中的作用尤為重要。本課題組前期已經(jīng)研究報(bào)道了肺炎鏈球菌感染小鼠巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)IL-1β成熟及分泌的詳細(xì)機(jī)制:肺炎鏈球菌感染巨噬細(xì)胞過程中,少量肺炎鏈球菌被巨噬細(xì)胞吞噬,后由于其毒力因子PLY的穿孔作用使吞噬體裂解,其中的內(nèi)容物被釋放至胞漿激活A(yù)IM2及NLRP3炎癥小體,通過活化caspase-1切割I(lǐng)L-1β前體并使之分泌。作為固有免疫系統(tǒng)中的重要一員,中性粒細(xì)胞可通過發(fā)揮吞噬作用,釋放一系列趨化因子、細(xì)胞因子,在宿主抗肺炎鏈球菌感染時(shí)發(fā)揮重要作用。同時(shí)中性粒細(xì)胞也是機(jī)體產(chǎn)生IL-1β的重要來源,且IL-1β與中性粒細(xì)胞在抗肺炎鏈球菌感染中的作用已經(jīng)明了,但肺炎鏈球菌是如何誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β仍不清楚,有待進(jìn)一步研究。對(duì)此,本研究使用肺炎鏈球菌感染小鼠腹腔中性粒細(xì)胞,研究肺炎鏈球菌感染中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)IL-1β加工分泌的機(jī)制。1.肺炎鏈球菌溶血素(PLY)在IL-1β成熟與分泌中的作用研究使用肺炎鏈球菌野生型菌株D39和ply基因缺失株△pl分別感染小鼠腹腔中性粒細(xì)胞,ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中的IL-1β、IL-1α、IL-6及TNFα分泌水平;使用Western blot方法檢測(cè)培養(yǎng)上清及細(xì)胞裂解物中IL-1β前體及成熟片段的蛋白表達(dá)水平。最后,為進(jìn)一步鑒定PLY在誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞IL-1β分泌中的作用,使用重組蛋白rPLY感染小鼠腹腔中性粒細(xì)胞,采用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌水平。以上試驗(yàn)結(jié)果顯示:肺炎鏈球菌菌株D39和△ply感染小鼠腹腔中性粒細(xì)胞后,均可引起細(xì)胞因子IL-1α、IL-6及TNFα分泌,且兩種菌株誘導(dǎo)的分泌水平無顯著差異,而△ply引起的IL-1β分泌量顯著低于D39;在D39和△ply感染中性粒細(xì)胞后,細(xì)胞裂解物中均可檢測(cè)到IL-1β前體片段,而IL-1β成熟片段僅在培養(yǎng)上清中檢測(cè)到;此外,使用rPLY感染中性粒細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)rPLY誘導(dǎo)的IL-1β分泌量呈劑量依賴型。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果揭示:在肺炎鏈球菌感染小鼠中性粒細(xì)胞時(shí),可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞分泌IL-1β、IL-1α、IL-6及TNFα等一系列細(xì)胞因子,且PLY參與了 IL-1β的成熟與分泌過程,并起到了關(guān)鍵性作用。2.NLRP3炎癥小體在肺炎鏈球菌感染小鼠中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)IL-1β成熟與分泌中的作用研究為鑒定中性粒細(xì)胞吞噬作用對(duì)IL-1β分泌的影響,在肺炎鏈球菌野生型菌株D39感染中性粒細(xì)胞前使用細(xì)胞松弛素B(Cytochalasin B,Cyto.B)處理小鼠腹腔中性粒細(xì)胞,而后通過ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌水平,結(jié)果顯示在使用Cyto.B處理后,IL-1β分泌顯著降低,揭示中性粒細(xì)胞對(duì)該病原菌的吞噬作用參與肺炎鏈球菌感染中性粒細(xì)胞時(shí)IL-1β的分泌。為確定NLRP3炎癥小體是否參與肺炎鏈球菌感染中性粒細(xì)胞時(shí)IL-1β成熟與分泌過程,使用肺炎鏈球菌野生型菌株D39 分別感染 C57BL/6WT 及 Caspase-1-/-、ASC-/-、NLRP3-/-、NLRC4-/-及 AIM2-/-炎癥小體組分敲除小鼠的腹腔中粒細(xì)胞,使用ELISA方法對(duì)培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌水平進(jìn)行檢測(cè),Western blot檢測(cè)培養(yǎng)上清中的IL-1β成熟形式及caspase-1活化形式,同時(shí)測(cè)定細(xì)胞裂解物中的IL-1β前體、caspase-1前體及NLRP3、ASC分子的蛋白表達(dá)水平,結(jié)果表明相較于WT小鼠中性粒細(xì)胞,Caspase-1-/-、ASC-/-、NLRP3-/-小鼠的中性粒細(xì)胞在肺炎鏈球菌D39感染后幾乎不分泌IL-1β,也檢測(cè)不到IL-1β、caspase-1成熟形式,而NLRC4-/-及AIM2-/-小鼠中性粒細(xì)胞中IL-1β分泌量與WT小鼠中性粒細(xì)胞的無明顯差異。為研究鉀離子外流對(duì)肺炎鏈球菌感染中性粒細(xì)胞時(shí)IL-1β分泌的影響,在肺炎鏈球菌野生型菌株D39感染小鼠中性粒細(xì)胞的同時(shí)于感染體系中加入高濃度的鉀離子以阻斷胞內(nèi)鉀離子外流,ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌水平,Western blot檢測(cè)培養(yǎng)上清中caspase-1活化形式,結(jié)果顯示在加入高濃度的鉀離子后,IL-1β分泌量顯著降低,也未檢測(cè)到caspase-1活化片段。此外,為研究炎癥小體上游的JNK及Syk信號(hào)通路在肺炎鏈球菌感染中性粒細(xì)胞時(shí)誘導(dǎo)IL-1β成熟與分泌中的作用,在肺炎鏈球菌野生型菌株D39感染前分別使用JNK、Syk抑制劑SP600125、R406處理中性粒細(xì)胞,而后ELISA檢測(cè)上清中IL-1β分泌水平,試驗(yàn)結(jié)果顯示:在使用JNK抑制劑預(yù)處理后IL-1β分泌量顯著降低;而后Western blot檢測(cè)D39感染后JNK分子的磷酸化水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在D39感染后各時(shí)間點(diǎn)JNK出現(xiàn)磷酸化,同時(shí)使用SP600125處理后個(gè)時(shí)間點(diǎn)JNK磷酸化水平均出現(xiàn)明顯降低。Western blot檢測(cè)使用兩種抑制劑分別處理后培養(yǎng)上清中IL-1β、caspase-1成熟形式及使用DSS交聯(lián)后細(xì)胞中ASC蛋白的寡聚化水平,結(jié)果顯示在使用SP600125處理后未檢測(cè)到IL-1β蛋白成熟形式、caspase-1活化片段且ASC寡聚化水平亦顯著降低。以上結(jié)果表明:在肺炎鏈球菌感染中性粒細(xì)胞時(shí),NLRP3炎癥小體通過活化caspase-1而參與IL-1β的成熟與分泌;鉀離子外流可通過影響caspase-1活化而影響IL-1β分泌;另外,炎癥小體上游的JNK通路在肺炎鏈球菌感染后可發(fā)生磷酸化并通過調(diào)節(jié)ASC分子的寡聚化水平進(jìn)而影響caspase-1活化及IL-1β的成熟與分泌;此外,中性粒細(xì)胞吞噬作用在IL-1β分泌中扮演了重要角色。3.絲氨酸蛋白酶類對(duì)肺炎鏈球菌感染中性粒細(xì)胞時(shí)誘導(dǎo)IL-1β成熟與分泌影響的研究為探究中粒細(xì)胞中的絲氨酸蛋白酶在肺炎鏈球菌感染中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)IL-1β成熟與分泌中的作用,在肺炎鏈球菌野生型菌株D39感染前使用絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF、中性粒細(xì)胞絲氨酸蛋白酶抑制劑ONO-5046、泛caspase抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)處理中性粒細(xì)胞,而后ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-1β分泌水平,Western blot檢測(cè)IL-1β成熟片段、caspase-1活化形式及使用DSS交聯(lián)后的ASC蛋白的寡聚化水平,結(jié)果顯示在使用PMSF及ONO-5046處理后,IL-1β分泌水平顯著降低,IL-1β成熟片段減少、caspase-1活化水平及ASC寡聚化水平均顯著降低。表明在肺炎鏈球菌感染中性粒細(xì)胞時(shí),絲氨酸蛋白酶可通過調(diào)節(jié)ASC寡聚化水平進(jìn)而影響caspase-1的活化及IL-1β的分泌水平。綜上所述,本研究使用肺炎鏈球菌感染小鼠中性粒細(xì)胞,證明了肺炎鏈球菌感染中性粒細(xì)胞過程中,PLY在誘導(dǎo)IL-1β成熟與分泌中發(fā)揮重要作用。肺炎鏈球菌被中性粒細(xì)胞吞噬,通過活化NLRP3炎癥小體激活caspase-1引起IL-1β分泌,且NLRP3炎癥小體上游的鉀離子外流及JNK信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)這一過程;此外,中性粒細(xì)胞絲氨酸蛋白酶也可通過調(diào)節(jié)ASC分子寡聚化影響caspase-1活化進(jìn)而參與IL-1β成熟與分泌。
【圖文】：

圖３－１邋ＳＰ以不同條件感染中性粒細(xì)胞后誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌逡逑２１逡逑

１２ｈ后ＥＬＩＳＡ檢測(cè)培養(yǎng)上猜中細(xì)胞囡子ＩＬ－ｉｐ、ＴＮＦａ、ＩＬ－ｌａ、ＩＬ－６的分泌情逡逑況。結(jié)果表明」和Ｄ３９菌株能夠誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞分泌這些細(xì)胞因子，，且其中逡逑Ｄ３９所引起得ＩＬ－ｉｐ分泌水平顯著高于傘（ｖ感染后的分泌量（圖３－２邋Ａ）；而兩種逡逑菌株所引起的ＴＮＦａ、ＩＬ－ｌａ、ＩＬ－６分泌水乎均無顯著差異（＊邋ｐ邋＜邋０．０５）（圖３－２逡逑Ｂ，Ｃ，Ｄ）．逡逑Ａ，邐Ｂ．邐Ｃ．邐Ｄ．逡逑１５００－１邐１５００－１邐４００００邋－逡逑ＩＩ：邋｜邋Ｉ－Ｊ邋１１邋！邐１１邋１邐１１逡逑Ｉ邋＾邐１１邋ｉ邋，0邋１１邋Ｉ邋２３０００邋１邋１逡逑0ｌｕＸ邋0ＬＵ邋：ｌｕＸ逡逑ＵＩ邋Ｄ３９邋Ｊｐｌｙ邐ＪＪＪ邋Ｄ３？邋Ｊｐｔｙ邐ＬＩ邋Ｄ３９邋Ａｐｌｙ邐ＬＩ邋Ｄ３９邋Ａｐｌｙ逡逑圖３－２肺炎鏈球菌感染中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌水平逡逑Ｆｉｇ．邋３－２邋Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｏｆ邋ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ邋ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ邋ｉｎ邋ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ邋ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ逡逑注：相較于」／辦組，＊ｐ＜０．０５逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ｓｙｍｂｏｌｓ邋ｉｎｄｉｃａｔｅ邋ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｖｅｒｓｕｓ邋Ａｐｌｙ邋ｇｒｏｕｐ，邋＊邋ｐ邋＜邋０．０５逡逑３．３．３邋ＰＬＹ參與中性粒細(xì)胞ＩＬ－１｜３的成熟與分泌逡逑用肺炎鏈球菌野生型菌株Ｄ３９和；基因敲除株卻分別感染小鼠腹腔中性粒逡逑細(xì)胞，１２邋ｈＭ邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測(cè)培養(yǎng)上清、細(xì)胞裂解物中ＩＬ－ｉｐ、Ｐｒｏ－ＩＬ－ｉｐ的蛋白逡逑表達(dá)水平
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 李瓊;肺炎鏈球菌自溶素LytA的結(jié)構(gòu)和功能研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2703563