【摘要】：黑素皮質素受體5(The melanocortin-5 receptor,MC5R)屬于G蛋白偶聯受體(G Protein-Coupled Receptors,GPCRs)。該受體被證實在脂質生成、骨骼肌脂肪酸氧化和脂肪細胞代謝等過程中發(fā)揮重要作用。然而,目前有關MC5R的研究主要集中在人和小鼠上,但對于禽類以及豬的研究較少。為了深入了解雞、鴨、鵝和豬MC5R(c/d/g/pMC5R)的功能,解析受體和配體在相互作用過程中細胞信號通路變化,同時為后期的藥物篩選或遺傳育種等提供理論基礎,我們克隆了四種動物的MC5R基因,構建了真核表達載體。根據前人研究對MC5R與配體結合至關重要的氨基酸位點進行了單點突變,得到了各3個突變體:c/d/gMC5R-D119A/F254A/H257A、pMC5R-D204A/F339A/H342A。將四種動物的 MC5R野生型和突變體分別轉染人胚胎腎細胞(Human Embryonic Kidney T cells,HEK293T)中,利用雙熒光素酶報告基因法和Western Blot測定配體作用下MC5R野生型和突變體胞內第二信使環(huán)磷酸腺苷水平(Cyclic adenosine monophosphate,cAMP)與細胞外調節(jié)蛋白激酶1/2(Extracellularregulatedproteinkinases l/2,ERK1/2)磷酸化水平的變化規(guī)律,以闡明體外表達的MC5R野生型與突變體對不同配體的反應活性及信號通路的差異。結果如下:1.設計引物,擴增出四種動物MC5R的編碼區(qū)序列,連接至pcDNA3.1(+)真核表達載體得到pcDNA3.1(+)-c/d/g/pMC5R,利用定點突變技術構建了各3個突變體。最終得到4種野生型和各3種突變體,共16個真核表達載體。2.將四種動物的MC5R野生型和突變體真核表達載體分別與螢火蟲和海腎熒光素酶報告質粒轉染至HEK293T中,檢測胞內基礎cAMP水平。結果顯示,c/d/gMC5R-F254A和pMC5R-H342A的基礎活性顯著升高,其他突變體與野生型的基礎活性相差不大。用不同濃度的不同配體刺激,檢測胞內cAMP水平的變化。結果顯示,c/d/gMC5R-D119A和pMC5R-D204A突變體對于所有的激動劑與拮抗劑均喪失了反應活性;c/d/gMC5R-F254A和 pMC5R-F339A 的反應活性明顯降低;c/d/gMC5R-H257A 和 pMC5R-H342A 對于 α-MSH和NDP-α-MSH表現出了反應活性下降或喪失;MC3R和MC4R的拮抗劑SHU9119在c/d/g/sMC5R表現出激動劑的作用,c/d/gMC5R-H257A對SHU9119的信號窗顯著增大;pMC5R-H342A對SHU9119表現為信號窗的減小和EC50升高。其中,我們僅檢測到了突變體c/d/gMC5R-F254A和pMC5R-F339A,對于拮抗劑AgRP的刺激有響應。3.將四種動物的MC5R和突變體真核表達載體分別轉染至HEK293T中,提取總蛋白,利用Western Blot檢測胞內ERK1/2的基礎磷酸化水平和配體刺激后的磷酸化水平。結果顯示,c/gMC5R-F254A/H257A 的 pERK1/2 基礎水平下降,pMC5R-F339A/H342A 的pERK1/2基礎水平顯著性升高,dMC5R的3個突變體無顯著性變化。在激動劑NDP-α-MSH 作用下,cMC5R-F254A 的 pERK1/2 水平升高,pMC5R-F254A 的 pERK1/2 水平下降,其余受體和突變體的pERK1/2水平均無明顯變化;在拮抗劑AgRP作用下,c/d/gMC5R-H257A 和 pMC5R 的 pERK1/2 均沒有顯著性變化,cMC5R-F254A 和 dMC5R-F254A 表現為pERK1/2水平升高,其余受體和突變體均表現為pERK1/2水平的降低。
【圖文】：

將上一步中的ＰＣＲ產物，用ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓ？ＩＩ邋Ｏｎｅ邋Ｓｔｅｐ邋Ｃｌｏｎｉｎｇ邋Ｋｉｔ與真核表達載體逡逑ｐｃＤＮＡ３．丨（＋）經同源重組方法連接，轉化至ＤＨ５ａ感受態(tài)細胞后，挑取單菌落送往測序，得逡逑到的結果如圖２．２所示。雞、鴨、鵝ＭＣ５Ｒ的測序結果顯示序列各與ＧｅｎｅＢａｎｋ中的一個逡逑預測序列完全一致；豬ＭＣ５Ｒ的測序結果比ＧｅｎｅＢａｎｋ的預測序列（１２３３ｂｐ）從５’端開始逡逑多了邋１０８ｂｐ￣１６４ｂｐ與２８８ｂｐ？３７１ｂｐ的片段，其余ＤＮＡ序列完全匹配。逡逑Ａ逡逑ＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＡＣＡＴＣＣＴＣＧＣＡＡＣＴＧＴＡＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＣＩＡＡＡＣＣＴＧＡＧＴＧＣＣＴＴＴＧＧＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＡＣＴ逡逑ＧＴＧＣＣＴＡＣＴＧＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＧＴＧＧＴＣＡＴＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＡＡＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＴ逡逑ＧＴＡ－＼ＧＣＣＴＣＣＴＴＧＡＡ－Ａ．ＡＴＡｒＣＴＴＡＧＴＧＡＴＡＴＧＴＧＣＡＡＴＡＧｒＴＡＡＧＡＡＣＡＡＧＡＡＣＴＴＡＣＡＴＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＡＴＴｒｒｒＴＴＧＴ逡逑ＴＴＧＣＡＧｍＡＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＴＡＧＣＧＴＧＴＣＴＡＡＴＧＣＴＴＧＧＧＡＧＡＣＣＡＴＡＡＣＡＡＴＡＴＡＣＴＴＡＡＴＡＡＡＣＡＡＴ逡逑ＡＧＧＣＡＣＡｒＡＡＴＴＡｒＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＴＴＣＧＴＣＣＧＴＣＡＴＡＴＡＧＡＣＡＡＴＧＴＣＴＴＴＧＡｒＴＣＡＣＴＧＡＴＣＴＧＣＡＴＡｒＣＴＧＴＧＧＴＧＧＣ逡逑ＴＴＣＣＡＴＧＴＧＣＡＧＴＴＴＧＣＴＧＧＣＡＡＴＡＧＣＡＧＴＡＧＡＣＡＧＡＴＡＴＡＴＣＡＣ

ｉ邐ｌ逡逑ｉ邐ｓ逡逑圖２．３邋ＭＣ５Ｒ核苷酸序列系統進化樹逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．３邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｏｆ邋ＭＣ５Ｒ邋ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ逡逑３．３重組質粒的電泳鑒定結果逡逑將提取的測序正確的ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｃ／ｄ／ｇ／ｐＭＣ５Ｒ，用超微量分光光度計測定核酸濃度逡逑后，稀釋成相同濃度，用１％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，，結果如圖２．４所示，３０＾０ｂｐ？５０００ｂｐ之逡逑間的條帶為超螺旋質粒，５０００ｂｐ以上為線性質粒，ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｃ／ｄ／ｇ／ｐＭｄ５Ｒ重組質粒與逡逑ｐｃＤＮＡ３．１（＋）空載體與預期大小一致，且樣品ＤＮＡ濃度接近。逡逑Ｍ邋１邐２邐３邐４邐５逡逑＿圍�。颍咤义希海海薄卞甯绣义蠄D２．４重組ＭＣ５Ｒ質粒的電泳鑒定逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．４邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＭＣ５Ｒ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐｌａｓｍｉｄ逡逑Ｍ，邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ，邋１，邋ｐｃＤＮＡ３．１邋（－＾ｙｃＭＣ５Ｒ，邋２，邋ｐｃＤＮＡ３．１邋（＾ｙｄＭＣ５Ｒ，逡逑
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S828;S834;S835;S831

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本文編號：2702003