【摘要】：黑素皮質(zhì)素受體5(The melanocortin-5 receptor,MC5R)屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G Protein-Coupled Receptors,GPCRs)。該受體被證實(shí)在脂質(zhì)生成、骨骼肌脂肪酸氧化和脂肪細(xì)胞代謝等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然而,目前有關(guān)MC5R的研究主要集中在人和小鼠上,但對(duì)于禽類以及豬的研究較少。為了深入了解雞、鴨、鵝和豬MC5R(c/d/g/pMC5R)的功能,解析受體和配體在相互作用過(guò)程中細(xì)胞信號(hào)通路變化,同時(shí)為后期的藥物篩選或遺傳育種等提供理論基礎(chǔ),我們克隆了四種動(dòng)物的MC5R基因,構(gòu)建了真核表達(dá)載體。根據(jù)前人研究對(duì)MC5R與配體結(jié)合至關(guān)重要的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行了單點(diǎn)突變,得到了各3個(gè)突變體:c/d/gMC5R-D119A/F254A/H257A、pMC5R-D204A/F339A/H342A。將四種動(dòng)物的 MC5R野生型和突變體分別轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞(Human Embryonic Kidney T cells,HEK293T)中,利用雙熒光素酶報(bào)告基因法和Western Blot測(cè)定配體作用下MC5R野生型和突變體胞內(nèi)第二信使環(huán)磷酸腺苷水平(Cyclic adenosine monophosphate,cAMP)與細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(Extracellularregulatedproteinkinases l/2,ERK1/2)磷酸化水平的變化規(guī)律,以闡明體外表達(dá)的MC5R野生型與突變體對(duì)不同配體的反應(yīng)活性及信號(hào)通路的差異。結(jié)果如下:1.設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增出四種動(dòng)物MC5R的編碼區(qū)序列,連接至pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體得到pcDNA3.1(+)-c/d/g/pMC5R,利用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了各3個(gè)突變體。最終得到4種野生型和各3種突變體,共16個(gè)真核表達(dá)載體。2.將四種動(dòng)物的MC5R野生型和突變體真核表達(dá)載體分別與螢火蟲(chóng)和海腎熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T中,檢測(cè)胞內(nèi)基礎(chǔ)cAMP水平。結(jié)果顯示,c/d/gMC5R-F254A和pMC5R-H342A的基礎(chǔ)活性顯著升高,其他突變體與野生型的基礎(chǔ)活性相差不大。用不同濃度的不同配體刺激,檢測(cè)胞內(nèi)cAMP水平的變化。結(jié)果顯示,c/d/gMC5R-D119A和pMC5R-D204A突變體對(duì)于所有的激動(dòng)劑與拮抗劑均喪失了反應(yīng)活性;c/d/gMC5R-F254A和 pMC5R-F339A 的反應(yīng)活性明顯降低;c/d/gMC5R-H257A 和 pMC5R-H342A 對(duì)于 α-MSH和NDP-α-MSH表現(xiàn)出了反應(yīng)活性下降或喪失;MC3R和MC4R的拮抗劑SHU9119在c/d/g/sMC5R表現(xiàn)出激動(dòng)劑的作用,c/d/gMC5R-H257A對(duì)SHU9119的信號(hào)窗顯著增大;pMC5R-H342A對(duì)SHU9119表現(xiàn)為信號(hào)窗的減小和EC50升高。其中,我們僅檢測(cè)到了突變體c/d/gMC5R-F254A和pMC5R-F339A,對(duì)于拮抗劑AgRP的刺激有響應(yīng)。3.將四種動(dòng)物的MC5R和突變體真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染至HEK293T中,提取總蛋白,利用Western Blot檢測(cè)胞內(nèi)ERK1/2的基礎(chǔ)磷酸化水平和配體刺激后的磷酸化水平。結(jié)果顯示,c/gMC5R-F254A/H257A 的 pERK1/2 基礎(chǔ)水平下降,pMC5R-F339A/H342A 的pERK1/2基礎(chǔ)水平顯著性升高,dMC5R的3個(gè)突變體無(wú)顯著性變化。在激動(dòng)劑NDP-α-MSH 作用下,cMC5R-F254A 的 pERK1/2 水平升高,pMC5R-F254A 的 pERK1/2 水平下降,其余受體和突變體的pERK1/2水平均無(wú)明顯變化;在拮抗劑AgRP作用下,c/d/gMC5R-H257A 和 pMC5R 的 pERK1/2 均沒(méi)有顯著性變化,cMC5R-F254A 和 dMC5R-F254A 表現(xiàn)為pERK1/2水平升高,其余受體和突變體均表現(xiàn)為pERK1/2水平的降低。
【圖文】：

將上一步中的ＰＣＲ產(chǎn)物，用ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓ？ＩＩ邋Ｏｎｅ邋Ｓｔｅｐ邋Ｃｌｏｎｉｎｇ邋Ｋｉｔ與真核表達(dá)載體逡逑ｐｃＤＮＡ３．丨（＋）經(jīng)同源重組方法連接，轉(zhuǎn)化至ＤＨ５ａ感受態(tài)細(xì)胞后，挑取單菌落送往測(cè)序，得逡逑到的結(jié)果如圖２．２所示。雞、鴨、鵝ＭＣ５Ｒ的測(cè)序結(jié)果顯示序列各與ＧｅｎｅＢａｎｋ中的一個(gè)逡逑預(yù)測(cè)序列完全一致；豬ＭＣ５Ｒ的測(cè)序結(jié)果比ＧｅｎｅＢａｎｋ的預(yù)測(cè)序列（１２３３ｂｐ）從５’端開(kāi)始逡逑多了邋１０８ｂｐ￣１６４ｂｐ與２８８ｂｐ？３７１ｂｐ的片段，其余ＤＮＡ序列完全匹配。逡逑Ａ逡逑ＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＡＣＡＴＣＣＴＣＧＣＡＡＣＴＧＴＡＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＣＩＡＡＡＣＣＴＧＡＧＴＧＣＣＴＴＴＧＧＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＡＣＴ逡逑ＧＴＧＣＣＴＡＣＴＧＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＧＴＧＧＴＣＡＴＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＡＡＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＴ逡逑ＧＴＡ－＼ＧＣＣＴＣＣＴＴＧＡＡ－Ａ．ＡＴＡｒＣＴＴＡＧＴＧＡＴＡＴＧＴＧＣＡＡＴＡＧｒＴＡＡＧＡＡＣＡＡＧＡＡＣＴＴＡＣＡＴＴＣＡＣＣＣＡＴＧＴＡＴＴｒｒｒＴＴＧＴ逡逑ＴＴＧＣＡＧｍＡＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＣＡＴＧＣＴＧＧＴＴＡＧＣＧＴＧＴＣＴＡＡＴＧＣＴＴＧＧＧＡＧＡＣＣＡＴＡＡＣＡＡＴＡＴＡＣＴＴＡＡＴＡＡＡＣＡＡＴ逡逑ＡＧＧＣＡＣＡｒＡＡＴＴＡｒＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＴＴＣＧＴＣＣＧＴＣＡＴＡＴＡＧＡＣＡＡＴＧＴＣＴＴＴＧＡｒＴＣＡＣＴＧＡＴＣＴＧＣＡＴＡｒＣＴＧＴＧＧＴＧＧＣ逡逑ＴＴＣＣＡＴＧＴＧＣＡＧＴＴＴＧＣＴＧＧＣＡＡＴＡＧＣＡＧＴＡＧＡＣＡＧＡＴＡＴＡＴＣＡＣ

ｉ邐ｌ逡逑ｉ邐ｓ逡逑圖２．３邋ＭＣ５Ｒ核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．３邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｏｆ邋ＭＣ５Ｒ邋ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ逡逑３．３重組質(zhì)粒的電泳鑒定結(jié)果逡逑將提取的測(cè)序正確的ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｃ／ｄ／ｇ／ｐＭＣ５Ｒ，用超微量分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度逡逑后，稀釋成相同濃度，用１％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，，結(jié)果如圖２．４所示，３０＾０ｂｐ？５０００ｂｐ之逡逑間的條帶為超螺旋質(zhì)粒，５０００ｂｐ以上為線性質(zhì)粒，ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｃ／ｄ／ｇ／ｐＭｄ５Ｒ重組質(zhì)粒與逡逑ｐｃＤＮＡ３．１（＋）空載體與預(yù)期大小一致，且樣品ＤＮＡ濃度接近。逡逑Ｍ邋１邐２邐３邐４邐５逡逑＿圍�。颍咤义希海海薄卞甯绣义蠄D２．４重組ＭＣ５Ｒ質(zhì)粒的電泳鑒定逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．４邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＭＣ５Ｒ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐｌａｓｍｉｄ逡逑Ｍ，邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ，邋１，邋ｐｃＤＮＡ３．１邋（－＾ｙｃＭＣ５Ｒ，邋２，邋ｐｃＤＮＡ３．１邋（＾ｙｄＭＣ５Ｒ，逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S828;S834;S835;S831

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本文編號(hào)：2702003