【摘要】：成熟的精子中包含編碼RNA和非編碼RNA,精子在受精時將這些RNA攜帶進入卵母細胞。越來越多的證據(jù)顯示精子miRNAs作為具有調(diào)控功能的內(nèi)源性小分子非編碼RNA,可以與卵母細胞內(nèi)靶基因的3’非翻譯區(qū)進行特異性堿基互補配對結(jié)合,降解或者抑制靶基因翻譯。從而對受精后胚胎表觀重編程、表觀遺傳、胚胎發(fā)育以及后代表型等產(chǎn)生重要影響。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)miRNA-183在牛精子中特異性高表達,對早期胚胎的發(fā)育起著重要的作用,并且通過生物信息學分析和雙熒光素實驗確定了Ezrin是其在早期胚胎中發(fā)揮功能的靶基因。在此基礎(chǔ)上,本研究主要開展以下三個方面的工作,(1)確定miRNA-183與靶基因Ezrin在早期胚胎中的調(diào)控關(guān)系;(2)通過敲降和過表達實驗,明確miRNA-183對早期胚胎具體表型的影響;(3)初步探討miRNA-183對早期胚胎發(fā)育的調(diào)控機制。主要研究成果如下:1.通過顯微注射的方法,向孤雌胚胎注射miRNA-183 mimic和miRNA-183 mimic NC。同時對孤雌胚胎顯微注射EZR siRNA和EZR siRNA NC作為對照,從RNA和蛋白水平驗證miRNA-183與其靶基因Ezrin的靶向調(diào)控關(guān)系。發(fā)現(xiàn)注射EZR siRNA的效果與注射miRNA-183 mimic的效果相似,都可以有效使Ezrin蛋白表達熒光強度顯著降低。同時通過qPCR和Western blot實驗證明miRNA-183可同時在mRNA和蛋白水平調(diào)控Ezrin表達量。2.功能獲得實驗表明miRNA-183顯著提高了牛體細胞核移植胚胎的卵裂率(76.63%vs 64.32%,P0.05)、囊胚率(43.75%vs 28.26%,P0.05),降低了第7 d囊胚凋亡率(5.21%vs 12.64%,P0.05),提高第7 d囊胚內(nèi)細胞團滋養(yǎng)層比例(32.65%vs25.58%,P0.05)。3.掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)SCNT胚胎表面微絨毛密度顯著高于IVF胚胎,向核移植胚胎顯微注射miRNA-183 mimic胚胎表面微絨毛密度顯著降低。注射EZR-siRNA也有相同的效果,結(jié)果表明miRNA-183可能通過靶基因Ezrin調(diào)控早期胚胎微絨毛形成,從而最終影響胚胎的發(fā)育潛能。4.通過生物信息學預測篩選與微絨毛功能作用相關(guān)并與Ezrin存在互作的蛋白,利用Co-IP結(jié)合質(zhì)譜篩選出相關(guān)蛋白,利用免疫熒光共定位的方法驗證Ezrin與這些互作蛋白在牛早期胚胎中的互作關(guān)系。為后續(xù)進一步探討miRNA-183通過其靶基因Ezrin調(diào)控胚胎早期微絨毛形成的機理研究奠定基礎(chǔ)。綜上所述,在前期研究的基礎(chǔ)上,本研究進一步明確了miRNA-183與其靶基因Ezrin的調(diào)控關(guān)系,研究了其對牛SCNT胚胎發(fā)育和微絨毛形成的影響,并篩選了與Ezrin互作的蛋白,為后續(xù)進一步研究miRNA-183通過其靶基因Ezrin調(diào)控牛早期胚胎發(fā)育的機理奠定基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S823

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本文編號：2701775