【摘要】：冷凍保存可以延長精子的保存時間,但是冷凍過程中會使精子的細胞和生理學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列的變化從而受到一定程度的損害,包括精子獲能的特征、精子壽命以及卵母細胞的相互作用和受精能力等。精液的冷凍保存就是利用干冰(-79℃)、液氮(-196℃)或者其它制冷的設(shè)備作為冷源,將精液經(jīng)過特殊的處理之后,保存在極低的溫度下,完全的抑制了精子的代謝活動,使得精子處于休眠狀態(tài),待升溫后復(fù)蘇,并且不失去受精的能力,從而使得精子達到了長期保存的方法。本試驗的目的是探究添加包埋膽固醇的甲基-β-環(huán)糊精(CLC)對牛冷凍精子質(zhì)量參數(shù)、抗氧化及抗凋亡能力的影響。試驗分對照組(0mg/ml)和不同劑量 CLC 處理組(0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml),分別測定凍融后牛精子的質(zhì)量參數(shù)、蛋白的酪氨酸磷酸化、抗氧化基因以及細胞凋亡基因的表達。試驗結(jié)果如下所示:1.在精液稀釋液中添加不同濃度的CLC處理組(0mg/ml、0.5mg/ml、1.0 mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml)。放入液氮中進行保存,保存5h以上,檢測出精子的活力與質(zhì)膜完整性,頂體膜的完整性均有不同程度的減弱。不同處理組之間無明顯差異。2.對照組(0mg/ml)凍融后獲能及處理組(0mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5 mg/ml、2.0 mg/m1)凍融后牛精子進行頂體膜蛋白分離、蛋白含量測定,并用SDS-PAGE和Western blot進行分析。結(jié)果表明:頂體蛋白在32KDa處可以看出0.5 mg/ml最接近獲能處理的精子。3.對于不同處理組(0mg/ml、0.5 mg/ml、1.0mg/ml、1.5 mg/ml、2.0mg/ml)先進行總RNA的提取,隨后進行反轉(zhuǎn)錄和RNA濃度的測定,根據(jù)引物設(shè)計和引物序列的參照表,隨后進行PCR的目的基因擴增,然后進行瓊脂糖凝膠電泳,最后對抗氧化基因表達量的檢測結(jié)果進行分析。結(jié)果表明:在CAT、GPx、SOD基因的表達量條帶上顯示0.5mg/ml和1.0mg/ml均顯著高于對照組(P0.05)。而在1.0mg/ml處顯示表達量最高。4.對于不同處理組(0mg/ml、0.5 mg/ml、1.0mg/ml、1.5 mg/ml、2.0mg/ml)先進行總RNA的提取,隨后進行反轉(zhuǎn)錄和RNA濃度的測定,根據(jù)引物設(shè)計和引物序列的參照表,隨后進行PCR的目的基因擴增,然后進行瓊脂糖凝膠電泳,最測結(jié)果進行分析。后細胞調(diào)亡基因的檢結(jié)果表明:在Caspase-3、Caspase-8和BAX基因的表達量條帶上顯示0.5 mg/ml和1.0 mg/ml均顯著低于對照組(P0.05)。在0.5mg/ml處理組處最低。
【圖文】：

邐延邊人Ｔ碩－Ｌ屮、Ｉｋ淪文邐逡逑１．５ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌＣＬＣ）的蛋白進行１＼＼＾６１１１１＇）１0１；分析，分另［］運用酉各l#酸磷逡逑酸化一抗與酶標二抗進行孵育之后，得出如圖３－３－１顯示，分子量大約在３２邋ＫＤａ逡逑處出現(xiàn)了蛋白條帶，將蛋白條帶進行分析，制出酪氨酸磷酸化水平的條帶灰度值逡逑（如圖３－３－］邋）邋，邋０．５邋ｍｇ／ｍｌ邋ＣＬＣ處理組精子蛋白的酪氨酸磷酸化水平與新鮮獲能逡逑處理組的酪氨酸磷酸化水平最為相近。說明在０．５邋ｍｇ／ｍｌ邋ＣＬＣ處理組精子發(fā)生獲逡逑能和“獲能樣”變化之后，蛋白酪氨酸磷酸化水平有一定程度上的上升。逡逑

圖３－３－２．不同濃度ＣＬＣ處理組對凍融的卞精子獲能處理后酪氨酸磷酸化水逡逑平的條帶灰度值逡逑Ｆｉｇｕｒｅ．３－３－２邋Ｇｒａｙ邋ｖａｌｕｅ邋ｏｆ邋ｂａｎｄｉｎｇ邋ｏｆ邋ｔｙｒｏｓｉｎｅ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌ邋ａｆｔｅｒ逡逑ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗｅｄ邋ｂｏｖｉｎｅ邋ｓｐｅｒｍ邋ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＣＬＣ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ逡逑ｇｒｏｕｐ逡逑３．邋４不同濃度的ＣＬＣ處理組對凍融牛精子抗氧化基因表達量的影逡逑響逡逑將添加了不同濃度ＣＬＣ進行冷凍保存的精子進行解凍之后，進行ＲＮＡ的逡逑提取，，然后進行ＰＣＲ擴增和ＤＮＡ電泳試驗。檢測精子內(nèi)的抗氧化基因ＣＡＴ、逡逑ＧＰｘ、ＳＯＤ、Ｇａｐｄｈ的表達量。根據(jù)所得出的條帶進行了分析之后，從而得出如逡逑下數(shù)據(jù)，從結(jié)果中可以看出在添加不Q嫶磣椋ǎ板澹恚紓恚�、０．５邋ｍ＜偗ｍｌ、Ξ０邋ｍ＜偗ｍＪn㈠義希卞澹咤澹靛澹礤澹紓礤澹蕁ⅲ玻板澹礤澹紓礤澹卞澹緬澹體澹茫╁�？保磱鼓精讬熏经过解冻之／Ｔｉ，精－／？脑懩抗衍O瘍婂義

本文編號：2700953