【摘要】：氣腫疽(Clostridium chauvoei)是一種急性、熱性、敗血性傳染病,主要感染反芻動(dòng)物,其典型癥狀為發(fā)病動(dòng)物肌肉豐滿部位發(fā)生炎性、氣性腫脹,觸壓有捻發(fā)音,患部皮膚干硬易形成壞疽,食欲減退,呼吸困難。該病的流行有一定的地域性和季節(jié)性,在天氣炎熱的多雨季節(jié)多發(fā)生于潮濕的山谷、牧場(chǎng)。近年來(lái)常有爆發(fā)氣腫疽的報(bào)道,為畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來(lái)了巨大的沖擊,同時(shí)也逐漸地威脅到人類的健康和經(jīng)濟(jì)。為了制備安全有效的氣腫疽核酸疫苗,有效控制該病的發(fā)生,本研究根據(jù)GenBank中已發(fā)表的氣腫疽梭菌NanA基因序列,設(shè)計(jì)合成了一對(duì)特異性引物,以氣腫疽梭菌總DNA為模板,擴(kuò)增出NanA目的基因并克隆至pMD 18-T simple載體,對(duì)測(cè)序正確的NanA基因進(jìn)行分析。將克隆質(zhì)粒pMD 18-T-NanA進(jìn)行雙酶切后,與pVAX1真核表達(dá)載體連接,成功構(gòu)建p VAX 1-NanA真核表達(dá)重組質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞,通過(guò)間接免疫熒光鑒定其表達(dá)。將成功構(gòu)建的pVAX1-NanA質(zhì)粒大量提取后免疫BALB/c小鼠,設(shè)置pVAX1-NanA核酸疫苗組、pVAX1空載體組和PBS對(duì)照組。對(duì)小鼠進(jìn)行采血并分離血清,通過(guò)ELISA法測(cè)定血清中的IgG,IgG1、IgG2a抗體水平和IFN-y、IL-4細(xì)胞因子水平。第三次免疫2周后,通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中的CD4+和CD8+水平。通過(guò)對(duì)小鼠的抗體水平、細(xì)胞因子水平和T細(xì)胞亞群含量檢測(cè),綜合評(píng)價(jià)小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫水平。研究結(jié)果表明:本試驗(yàn)成功擴(kuò)增了氣腫疽梭菌NanA基因,片段大小為1950bp,與參考序列相比,共存在3處核苷酸突變,核苷酸與氨基酸序列的同源性均為99.8%。該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)以β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲為主,蛋白表面有多個(gè)抗原表位區(qū)域。pVAX1-NanA核酸疫苗接種BALB/c小鼠后,其血清中IgG、IgG1和IgG2a的抗體水平顯著高于pVAX1空載體組和PBS對(duì)照組(P0.05);IFN-γ和IL-4細(xì)胞因 子水平極顯著高于pVAX1空載體組和PBS對(duì)照組(P0.01)。淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+分析表明,pVAX1-NanA核酸疫苗免疫組的CD4+和CD8+水平顯著高于 pVAX1 組和 PBS 對(duì)照組(P0.05),pVAX1-NanA極酸疫苗組的CD4+ 和 CD8+ 比值高于 pVAX1 空載體組與 PBS對(duì)照組,pVAX1空載體組和PBS對(duì)照組之間無(wú)顯著差異。本試驗(yàn)為NanA蛋白功能的深入研究提供了參考,為氣腫疽梭菌 NanA基因核酸疫苗的研發(fā)奠定了一定的基礎(chǔ)。
【圖文】：

延邊大學(xué)碩士學(xué)位論義－結(jié)果結(jié)果逡逑平板培養(yǎng)及鏡檢結(jié)果逡逑肉湯中形成卜．清清朗、底部松散的白色沉淀，將試管豎立端涌起，伴打惡臭味。涂片鏡檢可見(jiàn)革蘭氏ｍ件、兩端鈍呈單個(gè)存在，也坷見(jiàn)兩個(gè)相連見(jiàn)圖２。在血平板上生長(zhǎng)出，，有微弱的ｐ溶血見(jiàn)圖３。逡逑

延邊大學(xué)碩士學(xué)位論義－結(jié)果結(jié)果逡逑平板培養(yǎng)及鏡檢結(jié)果逡逑肉湯中形成卜．清清朗、底部松散的白色沉淀，將試管豎立端涌起，伴打惡臭味。涂片鏡檢可見(jiàn)革蘭氏ｍ件、兩端鈍呈單個(gè)存在，也坷見(jiàn)兩個(gè)相連見(jiàn)圖２。在血平板上生長(zhǎng)出，有微弱的ｐ溶血見(jiàn)圖３。逡逑
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2701315