【摘要】：氣腫疽(Clostridium chauvoei)是一種急性、熱性、敗血性傳染病,主要感染反芻動物,其典型癥狀為發(fā)病動物肌肉豐滿部位發(fā)生炎性、氣性腫脹,觸壓有捻發(fā)音,患部皮膚干硬易形成壞疽,食欲減退,呼吸困難。該病的流行有一定的地域性和季節(jié)性,在天氣炎熱的多雨季節(jié)多發(fā)生于潮濕的山谷、牧場。近年來常有爆發(fā)氣腫疽的報道,為畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來了巨大的沖擊,同時也逐漸地威脅到人類的健康和經(jīng)濟。為了制備安全有效的氣腫疽核酸疫苗,有效控制該病的發(fā)生,本研究根據(jù)GenBank中已發(fā)表的氣腫疽梭菌NanA基因序列,設(shè)計合成了一對特異性引物,以氣腫疽梭菌總DNA為模板,擴增出NanA目的基因并克隆至pMD 18-T simple載體,對測序正確的NanA基因進行分析。將克隆質(zhì)粒pMD 18-T-NanA進行雙酶切后,與pVAX1真核表達載體連接,成功構(gòu)建p VAX 1-NanA真核表達重組質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)染至Vero細胞,通過間接免疫熒光鑒定其表達。將成功構(gòu)建的pVAX1-NanA質(zhì)粒大量提取后免疫BALB/c小鼠,設(shè)置pVAX1-NanA核酸疫苗組、pVAX1空載體組和PBS對照組。對小鼠進行采血并分離血清,通過ELISA法測定血清中的IgG,IgG1、IgG2a抗體水平和IFN-y、IL-4細胞因子水平。第三次免疫2周后,通過流式細胞儀測定小鼠脾臟淋巴細胞中的CD4+和CD8+水平。通過對小鼠的抗體水平、細胞因子水平和T細胞亞群含量檢測,綜合評價小鼠的體液免疫和細胞免疫水平。研究結(jié)果表明:本試驗成功擴增了氣腫疽梭菌NanA基因,片段大小為1950bp,與參考序列相比,共存在3處核苷酸突變,核苷酸與氨基酸序列的同源性均為99.8%。該蛋白三級結(jié)構(gòu)以β-折疊和無規(guī)則卷曲為主,蛋白表面有多個抗原表位區(qū)域。pVAX1-NanA核酸疫苗接種BALB/c小鼠后,其血清中IgG、IgG1和IgG2a的抗體水平顯著高于pVAX1空載體組和PBS對照組(P0.05);IFN-γ和IL-4細胞因 子水平極顯著高于pVAX1空載體組和PBS對照組(P0.01)。淋巴細胞亞群CD4+、CD8+分析表明,pVAX1-NanA核酸疫苗免疫組的CD4+和CD8+水平顯著高于 pVAX1 組和 PBS 對照組(P0.05),pVAX1-NanA極酸疫苗組的CD4+ 和 CD8+ 比值高于 pVAX1 空載體組與 PBS對照組,pVAX1空載體組和PBS對照組之間無顯著差異。本試驗為NanA蛋白功能的深入研究提供了參考,為氣腫疽梭菌 NanA基因核酸疫苗的研發(fā)奠定了一定的基礎(chǔ)。
【圖文】：

延邊大學碩士學位論義－結(jié)果結(jié)果逡逑平板培養(yǎng)及鏡檢結(jié)果逡逑肉湯中形成卜．清清朗、底部松散的白色沉淀，將試管豎立端涌起，伴打惡臭味。涂片鏡檢可見革蘭氏ｍ件、兩端鈍呈單個存在，也坷見兩個相連見圖２。在血平板上生長出，，有微弱的ｐ溶血見圖３。逡逑

延邊大學碩士學位論義－結(jié)果結(jié)果逡逑平板培養(yǎng)及鏡檢結(jié)果逡逑肉湯中形成卜．清清朗、底部松散的白色沉淀，將試管豎立端涌起，伴打惡臭味。涂片鏡檢可見革蘭氏ｍ件、兩端鈍呈單個存在，也坷見兩個相連見圖２。在血平板上生長出，有微弱的ｐ溶血見圖３。逡逑
【學位授予單位】：延邊大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.61

【參考文獻】

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1 云巾宴;任春宇;車達;金清洙;段雪巖;司唯;金鑫;;氣腫疽梭菌延邊樣的分離鑒定[J];畜牧與獸醫(yī);2015年11期

2 云巾宴;任春宇;車達;段雪巖;司唯;金鑫;;氣腫疽梭菌PCR檢測方法的建立[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學;2015年10期

3 段雪巖;金東春;任春宇;車達;云巾宴;齊強;金鑫;;吉林延邊地區(qū)牛氣腫疽病的診斷報告[J];中國畜牧獸醫(yī);2015年10期

4 云巾宴;任春宇;車達;金清洙;段雪巖;司唯;金鑫;;氣腫疽的病因分析及防治措施[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2015年16期

5 陳發(fā)喜;蔡擴軍;范玉娟;何克明;王清平;;家畜氣腫疽的研究進展[J];草食家畜;2015年03期

6 云巾宴;任春宇;車達;金清洙;段雪巖;司唯;金鑫;;氣腫疽梭菌細胞毒素CctA基因的克隆及生物信息學分析[J];吉林農(nóng)業(yè)科學;2015年01期

7 董玉影;孫曉龍;金穎;李官浩;李玉林;梁成云;;延邊黃牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的思考與展望[J];肉類研究;2014年06期

8 郭四保;李龍華;鐘美付;呂白楊;;牛氣腫疽的診治與體會[J];中國動物保健;2013年12期

9 彭小兵;李旭妮;王楠;何宇;丁家波;蔣玉文;;二重PCR方法鑒別氣腫疽梭菌和腐敗梭菌[J];中國獸藥雜志;2011年03期

10 車達;金鑫;陳瑩瑩;費景春;姜丹丹;吳丹;王笑玉;;延邊黃牛氣腫疽間接ELISA診斷方法的建立[J];安徽農(nóng)業(yè)科學;2011年02期

本文編號：2701315