【摘要】：近年來在福建、廣東、浙江等地皆有新致病型番鴨呼腸孤病毒(New pathotype of muscovy duck reovirus,N-MDRV)病的報道;該病俗稱“番鴨新肝病”,主要剖檢病變?yōu)楦闻K不規(guī)則壞死、出血;患病鴨日齡愈小,病死率愈高,給養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前,有關(guān)廣東省N-MDRV的致病性及遺傳進(jìn)化分析方面的研究較少。σB蛋白作為N-MDRV主要的外衣殼蛋白,有良好的免疫原性和反應(yīng)原性。本研究旨在對廣東省N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13流行毒株的致病性、全基因序列進(jìn)行比較分析,同時對N-MDRV/DH13株σB蛋白的原核高效表達(dá)進(jìn)行初步研究。本研究將N-MDRV/SH12、N-MDRV/DH13株均以10~4.00.00 ELD_(50)的劑量經(jīng)眼鼻、肌注、爪墊途徑分別感染1日齡雛番鴨,N-MDRV/SH12攻毒組死亡率在10%~20%之間,N-MDRV/DH13攻毒組死亡率均為30%。為進(jìn)一步研究N-MDRV對雛番鴨和雛雞的致病性差異,將N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株分別肌注感染1日齡雛番鴨和雛雞。結(jié)果顯示:2株病毒感染雛番鴨3 d后飲食能力下降,有輕微腹瀉;感染7 d后臨床癥狀明顯,患病鴨剖檢病變?yōu)楦闻K大范圍壞死、出血,脾臟腫大、壞死,法氏囊萎縮(N-MDRV/SH12組)或壞死出血(N-MDRV/DH13組),N-MDRV/SH12組感染14 d后雛番鴨體重顯著下降(P0.01)。而N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株感染雛雞,均不能致死,部分患病雞感染3 d后飲食能力下降,被毛疏松,N-MDRV/SH12組感染14 d后雛雞體重顯著下降(P0.05);患病雞剖檢可見肝臟、脾臟病變類似于“番鴨新肝病”,但法氏囊眼觀無明顯病變。病理組織切片顯示:雛番鴨感染7 d后,肝臟、脾臟、法氏囊壞死灶內(nèi)有大量紅細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤,脾臟、法氏囊的淋巴細(xì)胞壞死、減少,感染后期脾臟可見肉芽腫結(jié)構(gòu)。以上結(jié)果表明,N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株感染雛番鴨和雛雞的致病性不同,但均可感染雛番鴨和雛雞的肝臟、脾臟。為研究N-MDRV不同致病性毒株基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及遺傳進(jìn)化關(guān)系,利用RT-PCR方法對N-MDRV/SH12、N-MDRV/DH13株全基因組序列進(jìn)行擴(kuò)增和測序。結(jié)果顯示:2株病毒間各基因片段核苷酸和氨基酸序列相似性較高,分別為97.1%~99.8%和97.5%~100.0%;與GenBank中N-MDRV、DRV、GRV參考毒株核苷酸和氨基酸序列相似性亦較高,分別為86.3%~99.6%和93.3%~100%。σC蛋白基因序列相似性及遺傳進(jìn)化樹的分析結(jié)果均顯示,相鄰地區(qū)的基因2型毒株其遺傳關(guān)系更近。σA、σB、σNS、μA蛋白變異位點(diǎn)有一定規(guī)律性;有共同變異位點(diǎn)的病毒株,其蛋白基因序列相似性和遺傳進(jìn)化樹分析的結(jié)果均顯示,該類病毒株遺傳關(guān)系更近。除μB蛋白基因外,其他9個蛋白基因片段序列相似性和遺傳進(jìn)化分析結(jié)果均顯示,水禽源呼腸孤病毒間親緣關(guān)系較近,與雞源ARV親緣關(guān)系較遠(yuǎn);經(jīng)SimPlot重組軟件分析這可能是基因2型的μB蛋白基因片段來源于ARV和ARV-Md基因重組的結(jié)果。以上結(jié)果表明,N-MDRV/SH12、N-MDRV/DH13株均屬于水禽呼腸孤病毒基因2型,且兩者遺傳演化關(guān)系較同分支的其他基因2型毒株更為相近。病毒株各蛋白氨基酸位點(diǎn)差異有可能會導(dǎo)致病毒致病性的不同。比較2株病毒和10株基因2型參考毒株各蛋白氨基酸變異位點(diǎn)及其潛在糖基化位點(diǎn)發(fā)現(xiàn),除了λB蛋白外,其他蛋白的潛在糖基化位點(diǎn)因氨基酸位點(diǎn)變異有所變化;σNS蛋白109、270位點(diǎn)的變異使得N-MDRV/SH12、N-MDRV/DH13株蛋白在pH 7.0時帶不同電荷;2株病毒σC、σB蛋白單個氨基酸位點(diǎn)的變異對蛋白預(yù)測抗原表位幾乎沒有影響,但蛋白抗原表位不局限于疏水性。以上結(jié)果僅對N-MDRV各蛋白氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行了初步分析,其位點(diǎn)的變異是否與毒株致病性相關(guān),還需得到毒株蛋白進(jìn)一步驗(yàn)證。為探究N-MDRV中與致病性相關(guān)的σB蛋白原核高效表達(dá),本研究選擇優(yōu)化致病性較強(qiáng)的N-MDRV/DH13σB蛋白基因密碼子,構(gòu)建的pET-32a(+)-σB-BL21(DE3)原核表達(dá)重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)出σB蛋白。在最佳的誘導(dǎo)條件下獲得σB蛋白的表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白量的32.3%,經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)σB重組蛋白主要以包涵體形式存在。再經(jīng)Ni~(2+)柱純化獲得高純度可溶性的σB蛋白,Western blotting分析顯示該蛋白具良好的反應(yīng)原性。本研究為N-MDRVσB蛋白基因疫苗、診斷試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 3-2 2 株 N-MDRV 不同途徑攻毒組的生存曲線圖表 3-1 雛番鴨感染 N-MDRV 14d 后主要組織病理變化器官 病理變化SH12 雛番鴨攻毒組（患鴨數(shù)/存活數(shù)）DH13 雛番鴨攻毒組（患鴨數(shù)/存活數(shù)）

雛番鴨主要組織器官病理變化
【學(xué)位授予單位】：佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.65

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1 梅敏敏;N-MDRV廣東株致病性、序列分析及σB蛋白的原核表達(dá)[D];佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院;2018年

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本文編號：2700490