【摘要】：中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome,MERS)是由中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)所引起的一種高度傳染性人獸共患病。自2012年首例MERS患者病例被確診以來,因其在全球范圍內(nèi)傳播范圍廣、致死率高而受到世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)的廣泛關(guān)注。2015年我國報(bào)道出現(xiàn)的首例輸入性MERS患者,這無疑為我國的MERS防控增加了挑戰(zhàn),也敲響了警鐘。流行病學(xué)調(diào)查表明,單峰駝是MERS-CoV的重要中間宿主,人可通過與病畜直接或間接接觸感染MERS-CoV。因此,加強(qiáng)針對(duì)MERS的新型疫苗研究,對(duì)單峰駝等動(dòng)物宿主進(jìn)行免疫源頭免疫是MERS防控的關(guān)鍵。近年來,隨著疫苗監(jiān)管部門對(duì)疫苗質(zhì)量、安全性要求的逐步升級(jí),經(jīng)簡單粗放生產(chǎn)的疫苗已不能滿足市場需求,必須提高疫苗純度,加強(qiáng)對(duì)疫苗的純化工藝探索研究。密度梯度離心法、沉淀法是病毒分離純化工藝的經(jīng)典方法,缺點(diǎn)是雜質(zhì)去除效果有限,疫苗純度低,安全性差,副作用大,無法線性放大應(yīng)用于規(guī)�；a(chǎn)。而一些新的分離純化技術(shù)如膜過濾、層析等因自動(dòng)化程度高、操作簡便、回收率高而受到廣泛關(guān)注。基于此,本研究旨在建立表達(dá)MERS-CoV S1蛋白重組狂犬病病毒rSRV9-MERS_(S1)的懸浮培養(yǎng)工藝,同時(shí)研究其濃縮純化方法,并且通過動(dòng)物試驗(yàn)評(píng)價(jià)純化病毒的免疫效果,為MERS新型疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。1、rSRV9-MERS_(S1)重組病毒懸浮培養(yǎng)的初步研究通過比較不同感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)下接毒后,BHK 21細(xì)胞的生長曲線和病毒滴度變化來確定最佳的MOI。同時(shí)對(duì)病毒的收獲時(shí)間、收獲次數(shù)等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化來確定病毒的懸浮培養(yǎng)條件。結(jié)果顯示:當(dāng)MOI=0.05時(shí),以2×10~6個(gè)/mL的細(xì)胞密度作為工作細(xì)胞密度,接毒后48 h病毒滴度可達(dá)2×10~8 TCID_(50)/mL。離心收取細(xì)胞上清,用相同體積的新鮮培養(yǎng)液均勻重懸細(xì)胞沉淀,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,病毒滴度可達(dá)2×10~9 TCID_(50)/mL。2、rSRV9-MERS_(S1)重組病毒的濃縮純化方法研究將收獲的病毒培養(yǎng)液滅活后,分別通過三種方法(醋酸鋅沉淀+Sepharose 4FF凝膠過濾層析、500 KD中空纖維超濾柱+Sepharose 4FF凝膠過濾層析、500 KD中空纖維超濾柱+Cellufine~TMM Sulfate親和層析)進(jìn)行純化,通過比較最終篩選出一種溫和、目的蛋白回收率高、純度高的純化方法。結(jié)果顯示:500 KD中空纖維超濾柱+Sepharose4FF凝膠過濾層析回收的抗原含量最高,50 mL重組病毒原液經(jīng)純化后可得到1.82 mg蛋白,雜蛋白去除率可高達(dá)97.02%;電鏡下觀察可見到純化的病毒粒子具有較好的形態(tài)。結(jié)合生產(chǎn)成本等方面綜合考慮,最終確定選用此種方法進(jìn)行病毒的濃縮純化。3、rSRV9-MERS_(S1)純化病毒的實(shí)驗(yàn)免疫研究通過500 KD中空纖維超濾柱+Sepharose 4FF凝膠過濾層析法來制備純化的病毒。同時(shí)將不同劑量(2μg、10μg、50μg)的純化病毒及未純化病毒免疫小鼠,通過測定抗MERS-CoV IgG抗體效價(jià)消長規(guī)律、抗MERS-CoV中和抗體水平等綜合評(píng)價(jià)純化病毒的免疫原性及免疫效果。結(jié)果顯示:在抗MERS-CoV IgG抗體效價(jià)及抗MERS-CoV中和抗體水平上,不同劑量組呈現(xiàn)劑量依賴性效應(yīng),且抗體水平隨著免疫次數(shù)的增加而升高;純化的病毒具有良好的免疫原性,且可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生良好的體液免疫應(yīng)答。與未純化病毒相比,純化病毒可誘導(dǎo)小鼠較早產(chǎn)生高水平的體液免疫應(yīng)答。
【圖文】：

）學(xué)位論文 懸起來，繼續(xù)置于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2 測定，剩余部分-80℃凍存。細(xì)胞生長變化細(xì)胞經(jīng)不同 MOI 接種后，細(xì)胞生長曲線的情=0.1 下細(xì)胞生長曲線基本一致。BHK 21 懸浮高峰，細(xì)胞密度為 5~6×106個(gè)/mL，顯微鏡下死亡細(xì)胞，48 h 后細(xì)胞密度開始下降，死亡106個(gè)/mL 左右。

結(jié)果純化結(jié)果如表 2-1 所示。100 mL 病毒滴度為 2×108T經(jīng)過醋酸鋅沉淀+ Sepharose 4FF 凝膠過濾層析純化，5 mg/mL 的純化抗原。相同滴度的 100 mL 重組病毒原濾柱濃縮為 5 mL。取 2.5 mL（相當(dāng)于 50 mL 病毒原液膠過濾層析純化，收獲 1.5 mL 蛋白濃度為 1.21 mg/m 經(jīng)過 CellufineTMSulfate 親和層析純化，獲得 1.5 mL 蛋化抗原，純化抗原含量是 500 KD 中空纖維超濾柱+S析純化方法的二分之一。病毒純化過程中，Sepharose 蛋白峰，第 1 峰為 rSRV9-MERSS1峰，，第 2 峰為雜蛋ate 親和層析法純化病毒的峰值圖譜（見圖 2-1），洗脫峰。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2699530