發(fā)布時間：2020-06-06 05:41

【摘要】：肌內(nèi)脂肪含量是影響肉質(zhì)風(fēng)味的關(guān)鍵因素,豬不同部位肌肉組織的肌內(nèi)脂肪含量存在差異,從而影響了不同部位肉質(zhì)的口感,而有關(guān)豬肌內(nèi)脂肪在不同部位差異性沉積的調(diào)控機(jī)制尚不明確。轉(zhuǎn)錄組測序能夠揭示生物在某種特定功能狀態(tài)下幾乎所有轉(zhuǎn)錄本信息,在動物育種工作中的應(yīng)用越來越深入。本研究通過構(gòu)建不同分化時期(分化0天、2天和8天)分離自豬背最長肌(Ld)和半腱肌(Sd)的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的cDNA文庫,利用RNA-seq技術(shù)進(jìn)行測序,對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控過濾后,篩選出差異基因,并基于差異基因進(jìn)行GO功能和Pathway顯著性富集分析等,揭示影響豬肌內(nèi)脂肪差異性沉積的調(diào)控機(jī)制,為豬遺傳育種提供理論基礎(chǔ)。本研究通過測序發(fā)現(xiàn)了水/甘油通道蛋白成員AQP3在豬Ld肌內(nèi)脂肪中表達(dá)顯著高于Sd,但目前關(guān)于AQP3對肌內(nèi)脂肪沉積的作用并不明確。為驗證AQP3對豬肌內(nèi)脂肪沉積的作用,本研究首先利用實時定量PCR檢測了AQP3在豬不同部位的組織表達(dá)譜以及在肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)規(guī)律,之后采用RNAi技術(shù)干擾AQP3后,用實時定量PCR、WB、油紅O、Bodipy染色及CCK-8、EdU染色等多種方法探索其對肌內(nèi)脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響。上述研究獲得以下主要結(jié)果:1.分離自豬背最長肌和半腱肌的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞,在分化0、2、8天收集RNA進(jìn)行測序,篩選出的差異基因數(shù)量分別為186、819和548個,其中半腱肌相較于背最長肌而言,上調(diào)基因分別有139、284及339個,下調(diào)基因分別有47、535及209個。2.對篩選到的差異基因進(jìn)行GO功能富集分析,發(fā)現(xiàn)肌內(nèi)脂肪沉積水平較高的部位(即背最長肌)富集度較高的生物學(xué)過程包括對養(yǎng)分的應(yīng)答、長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運、對糖皮質(zhì)激素的應(yīng)答、脂質(zhì)儲存、甘油三酯代謝以及脂肪細(xì)胞分化的正向調(diào)節(jié)等方面;在Pathway富集分析中,在背最長肌中上調(diào)的信號通路主要有PPAR信號通路、脂肪酸代謝、脂肪酸延伸、丙酮酸代謝、三羧酸循環(huán)和不飽和脂肪酸的生物合成等,即與半腱肌相比,脂質(zhì)代謝相關(guān)通路在背最長肌肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中顯著富集。3.測序數(shù)據(jù)及qPCR驗證結(jié)果均顯示AQP3在背最長肌中的表達(dá)顯著高于半腱肌;AQP3在豬不同組織中廣泛表達(dá),其中在脂肪組織中表達(dá)量最高,腎臟次之;AQP3在肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,于分化第4天達(dá)到高峰值。4.干擾AQP3顯著降低了成脂標(biāo)志基因PPARγ、aP2和脂質(zhì)合成相關(guān)基因ACACA、SCD、DGAT2、mGPAT、ELOVL6和FASN的表達(dá)量,顯著抑制了脂滴的形成,說明干擾AQP3能夠抑制豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的分化。5.干擾AQP3顯著降低了細(xì)胞周期蛋白Cyclin B、Cyclin D、Cyclin E及其依賴性激酶CDK4的表達(dá),并且抑制了細(xì)胞活性,說明干擾AQP3能夠抑制豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的增殖。綜上,本研究通過RNA-seq篩選出背最長肌和半腱肌肌內(nèi)脂肪的差異基因,GO和KEGG pathway分析顯示脂質(zhì)儲存、脂肪酸代謝等通路在成脂能力較強(qiáng)的背最長肌肌內(nèi)脂肪中顯著富集。此外,本研究發(fā)現(xiàn)AQP3在背最長肌肌內(nèi)脂肪中高表達(dá),干擾AQP3顯著抑制了豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的分化和增殖,提示AQP3可能與不同部位肌內(nèi)脂肪的沉脂能力有關(guān)。本研究全面解析了不同部位的肌內(nèi)脂肪差異性沉積的分子基礎(chǔ),并明確了AQP3對肌內(nèi)脂肪細(xì)胞成脂的促進(jìn)作用,為完善豬肌內(nèi)脂肪差異性沉積的調(diào)控機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

板衍生生長因子受體α（PDGFRα）和干細(xì)胞抗原（Sca-1）均是成脂有 PDGFRα+/ CD45-和 Sca-1+/ CD34+/ CD45 特點的細(xì)胞就是具有高成Gulyaeva et al. 2018; Iwayama et al. 2015）。在脂肪組織中約有 15%到體脂肪細(xì)胞自基質(zhì)血管細(xì)胞分化形成，這些細(xì)胞存在于脂肪血管中uel-De Mouzon S 2011; Tan et al. 2011）。如圖 1-1 所示，間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)育，受多種因素影響，能夠分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞組織等（Hu et al. 2018; Gesta et al. 2007）。

圖1-2 RNA-seq測序步驟Fig 1-2 A typical RNA-seq experiment生物信息學(xué)分析生物信息學(xué)分析流程如圖 1-3 所示，由 Illumina HiSeq raw reads，其中包含了測序加上的接頭序列和一些低質(zhì)控（Quality Control, QC），以保證測序數(shù)據(jù)能夠達(dá)到要將過濾獲得的 clean reads 比對到參考序列，判斷比對結(jié)of alignment）后，進(jìn)行基因和轉(zhuǎn)錄本定量分析、基因結(jié)可變剪切等相關(guān)分析，并基于定量結(jié)果篩選出的差異logy）功能和 Pathway 顯著性富集分析等更深入的數(shù)據(jù). 2018; Raghavachari et al. 2018; Peng et al. 2012）。成功案例其強(qiáng)大的功能，目前已應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、醫(yī)學(xué)診斷和生不菲的成績。Zhang 等通過水稻轉(zhuǎn)錄組測序項目發(fā)現(xiàn) R的低豐度基因（Zhang et al. 2010）。Ren 等通過對來
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S828

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 陳粉粉;豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化過程miRNA的鑒定及miR-34c的功能研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2017年

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本文編號：2699244