【摘要】：miRNA參與卵巢類固醇激素合成與分泌、細胞增殖與凋亡等多種生理過程,對卵泡發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),miR-181a-5p在鵝卵泡顆粒層中高表達,可能參與顆粒細胞的增殖凋亡過程,有關(guān)miR-181a-5p在禽類顆粒細胞中的功能研究尚未見報道。因此,本研究利用生物信息學方法預(yù)測miR-181a-5p可能的靶基因及信號通路,在細胞水平上進一步探索miR-181a-5p對鵝顆粒細胞增殖凋亡的影響及其調(diào)控機制。其主要結(jié)果如下:(1)生物信息學分析表明,miR-181a-5p可能通過SIRT1、BCL2、CDKN1B、PTEN等靶基因參與FOXO信號通路調(diào)控顆粒細胞增殖凋亡過程。(2)qPCR結(jié)果分析表明,miR-181a-5p在2-4 mm表達最高,4-6 mm表達最低,之后在4-6 mm、8-10 mm、F5這三個階段均呈現(xiàn)顯著上升趨勢。聚類分析發(fā)現(xiàn),miR-181a-5p與其靶基因的表達模式在8-10 mm、F5階段發(fā)生了較大的變化,而與細胞增殖凋亡相關(guān)基因SIRT1、BCL2、CDKN1B、PTEN聚為一類,表明miR-181a-5p及其靶基因可能參與顆粒細胞增殖凋亡過程的調(diào)控。(3)通過濃度梯度轉(zhuǎn)染mimic和inhibitor發(fā)現(xiàn),在顆粒細胞中,mimic和inhibitor的最佳轉(zhuǎn)染濃度分別為50 nM和120 nM。MTT檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染mimic能顯著降低細胞活力(P0.05),轉(zhuǎn)染inhibitor能使細胞活力增強(P0.05)。(4)在過表達miR-181a-5p后,細胞增殖標志基因PCNA和抗凋亡基因BCL2的表達均顯著下降(P0.05),而細胞凋亡相關(guān)基因TP53、BAX、CASP3表達顯著上升(P0.05)。在抑制miR-181a-5p后,呈現(xiàn)出相反的結(jié)果。表明miR-181a-5p具有抑制顆粒細胞增殖、促進凋亡的作用。(5)通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn),共轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒和mimic時,熒光素酶活性顯著下降(P0.05),當結(jié)合位點被突變后,熒光素酶活性顯著上升(P0.05),表明miR-181a-5p可靶向結(jié)合SIRT1-3′UTR,抑制其mRNA水平的表達。(6)過表達miR-181a-5p后,FOXO信號通路的核心基因FOXO1及下游基因CDKN1A、CDKN1B的表達量均出現(xiàn)顯著上升(P0.05),而細胞存活調(diào)節(jié)因子AKT1表達量顯著下降。表明miR-181a-5p可能通過靶基因SIRT1參與FOXO信號通路引起顆粒細胞凋亡。綜上,miR-181a-5p可通過介導SIRT1參與FOXO信號通路調(diào)控顆粒細胞的增殖凋亡。本研究為深入探究miR-181a-5p在鵝顆粒細胞中的調(diào)控機制奠定了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1-1 miRNA 的生物合成[9]Fig 1-1 Biogenesis of microRNAsA 的作用機制對其靶基因的調(diào)控作用主要是負調(diào)控，但是也存在正堿基被稱為種子序列，miRNA 主要通過其種子序列以靶基因的 3′UTR 區(qū)域，進而通過對靶基因 mRNA 的下調(diào)靶基因的表達，最終實現(xiàn)對其靶基因轉(zhuǎn)錄后水平要取決于 miRNA 與其靶基因 mRNA 的互補程度。結(jié)合多數(shù)不是完全的堿基互補配對，通常只要保證其能實現(xiàn)對靶基因的調(diào)控[12]。在動物中，miRNA 沉默主切割的方式影響靶基因 mRNA 的穩(wěn)定性[13]。miR式通常在植物中較為常見，這種結(jié)合方式可導致靶基年來研究表明，miRNA 結(jié)合的區(qū)域還可能是基因的

圖 1-2 miRNA 參與卵泡的發(fā)育過程[19]Fig 1-2 MicroRNAinvolved in regulation of ovarian follicle developmentiRNA 在顆粒細胞增殖凋亡中的作用表明，miRNA 對顆粒細胞的增殖、分化、凋亡均具有重要的調(diào)控的增殖分化狀況直接影響卵泡的生長發(fā)育。miRNA 在顆粒細胞中以促進顆粒細胞的增殖又可以抑制顆粒細胞的增殖（表 1-1）。JimiR-93 可以直接靶向 CDKN1A 啟動顆粒細胞增殖和細胞周期 可通過靶向抑制凋亡信號調(diào)節(jié)酶 ASK1 的表達，增加顆粒細胞的生[31]發(fā)現(xiàn) miR-19b 靶向抑制 IGF-1 的表達，，而在抑制 miR-19b 后可以殖。Yin 等[32]研究表明，在小鼠顆粒細胞中，過表達 miR-320 可SF-1 的表達，進而抑制顆粒細胞的增殖，而 miR-383 則可啟動 mi抑制作用能夠被進一步增強。Yan 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，miR-145 能夠直IB 的表達，導致顆粒細胞的增殖被抑制。miR-143 可通過靶向作用
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S835

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本文編號：2699742