【摘要】：miRNA參與卵巢類(lèi)固醇激素合成與分泌、細(xì)胞增殖與凋亡等多種生理過(guò)程,對(duì)卵泡發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),miR-181a-5p在鵝卵泡顆粒層中高表達(dá),可能參與顆粒細(xì)胞的增殖凋亡過(guò)程,有關(guān)miR-181a-5p在禽類(lèi)顆粒細(xì)胞中的功能研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-181a-5p可能的靶基因及信號(hào)通路,在細(xì)胞水平上進(jìn)一步探索miR-181a-5p對(duì)鵝顆粒細(xì)胞增殖凋亡的影響及其調(diào)控機(jī)制。其主要結(jié)果如下:(1)生物信息學(xué)分析表明,miR-181a-5p可能通過(guò)SIRT1、BCL2、CDKN1B、PTEN等靶基因參與FOXO信號(hào)通路調(diào)控顆粒細(xì)胞增殖凋亡過(guò)程。(2)qPCR結(jié)果分析表明,miR-181a-5p在2-4 mm表達(dá)最高,4-6 mm表達(dá)最低,之后在4-6 mm、8-10 mm、F5這三個(gè)階段均呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)。聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn),miR-181a-5p與其靶基因的表達(dá)模式在8-10 mm、F5階段發(fā)生了較大的變化,而與細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)基因SIRT1、BCL2、CDKN1B、PTEN聚為一類(lèi),表明miR-181a-5p及其靶基因可能參與顆粒細(xì)胞增殖凋亡過(guò)程的調(diào)控。(3)通過(guò)濃度梯度轉(zhuǎn)染mimic和inhibitor發(fā)現(xiàn),在顆粒細(xì)胞中,mimic和inhibitor的最佳轉(zhuǎn)染濃度分別為50 nM和120 nM。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染mimic能顯著降低細(xì)胞活力(P0.05),轉(zhuǎn)染inhibitor能使細(xì)胞活力增強(qiáng)(P0.05)。(4)在過(guò)表達(dá)miR-181a-5p后,細(xì)胞增殖標(biāo)志基因PCNA和抗凋亡基因BCL2的表達(dá)均顯著下降(P0.05),而細(xì)胞凋亡相關(guān)基因TP53、BAX、CASP3表達(dá)顯著上升(P0.05)。在抑制miR-181a-5p后,呈現(xiàn)出相反的結(jié)果。表明miR-181a-5p具有抑制顆粒細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的作用。(5)通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),共轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒和mimic時(shí),熒光素酶活性顯著下降(P0.05),當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)被突變后,熒光素酶活性顯著上升(P0.05),表明miR-181a-5p可靶向結(jié)合SIRT1-3′UTR,抑制其mRNA水平的表達(dá)。(6)過(guò)表達(dá)miR-181a-5p后,FOXO信號(hào)通路的核心基因FOXO1及下游基因CDKN1A、CDKN1B的表達(dá)量均出現(xiàn)顯著上升(P0.05),而細(xì)胞存活調(diào)節(jié)因子AKT1表達(dá)量顯著下降。表明miR-181a-5p可能通過(guò)靶基因SIRT1參與FOXO信號(hào)通路引起顆粒細(xì)胞凋亡。綜上,miR-181a-5p可通過(guò)介導(dǎo)SIRT1參與FOXO信號(hào)通路調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖凋亡。本研究為深入探究miR-181a-5p在鵝顆粒細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1-1 miRNA 的生物合成[9]Fig 1-1 Biogenesis of microRNAsA 的作用機(jī)制對(duì)其靶基因的調(diào)控作用主要是負(fù)調(diào)控，但是也存在正堿基被稱(chēng)為種子序列，miRNA 主要通過(guò)其種子序列以靶基因的 3′UTR 區(qū)域，進(jìn)而通過(guò)對(duì)靶基因 mRNA 的下調(diào)靶基因的表達(dá)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)其靶基因轉(zhuǎn)錄后水平要取決于 miRNA 與其靶基因 mRNA 的互補(bǔ)程度。結(jié)合多數(shù)不是完全的堿基互補(bǔ)配對(duì)，通常只要保證其能實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的調(diào)控[12]。在動(dòng)物中，miRNA 沉默主切割的方式影響靶基因 mRNA 的穩(wěn)定性[13]。miR式通常在植物中較為常見(jiàn)，這種結(jié)合方式可導(dǎo)致靶基年來(lái)研究表明，miRNA 結(jié)合的區(qū)域還可能是基因的

圖 1-2 miRNA 參與卵泡的發(fā)育過(guò)程[19]Fig 1-2 MicroRNAinvolved in regulation of ovarian follicle developmentiRNA 在顆粒細(xì)胞增殖凋亡中的作用表明，miRNA 對(duì)顆粒細(xì)胞的增殖、分化、凋亡均具有重要的調(diào)控的增殖分化狀況直接影響卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育。miRNA 在顆粒細(xì)胞中以促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖又可以抑制顆粒細(xì)胞的增殖（表 1-1）。JimiR-93 可以直接靶向 CDKN1A 啟動(dòng)顆粒細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期 可通過(guò)靶向抑制凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)酶 ASK1 的表達(dá)，增加顆粒細(xì)胞的生[31]發(fā)現(xiàn) miR-19b 靶向抑制 IGF-1 的表達(dá)，，而在抑制 miR-19b 后可以殖。Yin 等[32]研究表明，在小鼠顆粒細(xì)胞中，過(guò)表達(dá) miR-320 可SF-1 的表達(dá)，進(jìn)而抑制顆粒細(xì)胞的增殖，而 miR-383 則可啟動(dòng) mi抑制作用能夠被進(jìn)一步增強(qiáng)。Yan 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，miR-145 能夠直IB 的表達(dá)，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞的增殖被抑制。miR-143 可通過(guò)靶向作用
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S835

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本文編號(hào)：2699742