【摘要】：胚胎附植的第一個(gè)重要過(guò)程是建立子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和囊胚的聯(lián)系。在反芻動(dòng)物中,附植過(guò)程的順利完成需要具有良好容受性的子宮內(nèi)膜以及纖維狀的孕體。研究表明,三分之二的妊娠失敗是由于子宮容受性異常導(dǎo)致的,因此子宮內(nèi)膜在妊娠維持和建立的過(guò)程中發(fā)揮十分重要的作用。在山羊胚胎植入期,子宮內(nèi)膜會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)的改變,主要是受到母體來(lái)源的孕酮(P_4)、雌二醇(E_2)和孕體來(lái)源干擾素-Tau(IFN-τ)等激素的共同調(diào)控。孕酮和雌二醇可以刺激子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞和淺層腺上皮細(xì)胞一些編碼酶和分泌蛋白表達(dá),干擾素-tau可以增加這些基因表達(dá)并參與調(diào)控孕體發(fā)育和附植。盡管在反芻動(dòng)物的胚胎附植過(guò)程中已經(jīng)確定了數(shù)萬(wàn)種基因和許多調(diào)控因子的表達(dá),但激素對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞功能的調(diào)控機(jī)制并不完全清楚。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)介導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)參與了眾多生理學(xué)、病理學(xué)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)UPR調(diào)控因子GRP78和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)反應(yīng)調(diào)控蛋白CREB募集因子(CREBRF)在小鼠附植位點(diǎn)表達(dá)升高,說(shuō)明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及相關(guān)因子可能參與妊娠過(guò)程。本研究利用孕酮、雌二醇和干擾素-tau模擬山羊妊娠早期子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞所處的激素環(huán)境。通過(guò)慢病毒干擾技術(shù),運(yùn)用Real time PCR、Western Blot、細(xì)胞免疫熒光染色、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)和CCK-8等方法,研究了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和相關(guān)因子在激素調(diào)控山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞功能的分子機(jī)制。主要的試驗(yàn)結(jié)果如下:(1)孕酮、雌二醇和干擾素-tau共同作用山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞,促進(jìn)促孕體伸長(zhǎng)基因ISG15、CXCL10和RSAD2的表達(dá),提高PGE_2:PGF_(2α)比例,增強(qiáng)胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞球粘附比率;并促進(jìn)未折疊蛋白反應(yīng)標(biāo)志蛋白GRP78、CHOP、phosphoIRE1、Cleaved ATF6和phophoEIF2S1表達(dá)。(2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑毒胡蘿卜素預(yù)處理增強(qiáng)未折疊蛋白反應(yīng)標(biāo)志蛋白GRP78、CHOP、phosphoIRE1、Cleaved ATF6和phophoEIF2S1表達(dá),促進(jìn)促孕體伸長(zhǎng)基因ISG15、CXCL10和RSAD2的表達(dá),上調(diào)PGE_2:PGF_(2α)比率,提高胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞球粘附比率;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4苯基丁酸預(yù)處理抑制未折疊蛋白反應(yīng),但PGE_2:PGF_(2α)比率和細(xì)胞粘附水平并沒(méi)有顯著影響。(3)設(shè)計(jì)并構(gòu)建了針對(duì)山羊ATF6干擾載體。使用倍比稀釋的方法檢測(cè)包裝的shATF6病毒滴度為5-10?10~7 TU/mL,并在山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞上檢測(cè)慢病毒干擾效率。抑制ATF6表達(dá)顯著增強(qiáng)了促進(jìn)促孕體伸長(zhǎng)基因ISG15、CXCL10和RSAD2的表達(dá),降低了PGE_2:PGF_(2α)比例,提高了胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞球粘附比率,增加了細(xì)胞粘附相關(guān)基因SPP1的表達(dá)。mTOR通路抑制劑雷帕霉素預(yù)處理shATF6 EECs,抑制了促進(jìn)促孕體伸長(zhǎng)基因CXCL10表達(dá),提高PGE_2:PGF_(2α)比例,但細(xì)胞粘附能力沒(méi)有受到顯著影響。(4)孕酮、雌二醇和干擾素-tau共同作用山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增強(qiáng)CREBRF和自噬標(biāo)志蛋白LC3-II的表達(dá)。設(shè)計(jì)并構(gòu)建了針對(duì)山羊CREBRF干擾載體。使用倍比稀釋的方法檢測(cè)包裝的shCREBRF病毒滴度為5-10?10~7 TU/mL,并在山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞上檢測(cè)慢病毒干擾效率。干擾CREBRF表達(dá)抑制CCNA2、CCNB1和CCND1的mRNA表達(dá),使EECs阻滯在S期導(dǎo)致EECs增殖速率顯著降低shCREBRF組PGE_2:PGF_(2α)比例和子宮容受性標(biāo)志基因HOXA10和HOXA11表達(dá)低于對(duì)照組,并抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞球粘附比率和SPP1表達(dá)。(5)雷帕霉素預(yù)處理shCREBRF EECs恢復(fù)了CREBRF表達(dá)抑制導(dǎo)致的PGE_2:PGF_(2α)比例降低,提高了HOXA10和HOXA11 mRNA水平表達(dá),但是抑制mTOR通路對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞球粘附比率和SPP1表達(dá)的影響不顯著。使用氯喹抑制shCREBRF EECs晚期自噬過(guò)程降低了PGE_2:PGF_(2α)比例,抑制了HOXA10 mRNA水平表達(dá),而氯喹預(yù)處理沒(méi)有顯著影響滋養(yǎng)層細(xì)胞球粘附比率,也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)SPP1的轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生顯著改變。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)參與到了山羊早期妊娠期間激素對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞功能的調(diào)控,并部分揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子ATF6和CREBRF對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞功能的分子調(diào)控機(jī)制,為進(jìn)一步揭示山羊早期妊娠過(guò)程子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞功能調(diào)控的分子機(jī)制提供新的理論依據(jù)。
【圖文】：

第一章 反芻動(dòng)物妊娠建立的研究進(jìn)展子宮內(nèi)膜容受性（附植窗口期），是在妊娠早期有限的一個(gè)階段內(nèi)，發(fā)生分子胞水平的生物學(xué)過(guò)程促進(jìn)胚胎附植并建立妊娠。在附植窗口期，子宮內(nèi)膜組結(jié)構(gòu)和功能的變化，從而建立最佳的子宮環(huán)境幫助胚胎植入 (Qu et al., 2018)究表明，子宮內(nèi)膜容受性的發(fā)育不良是導(dǎo)致妊娠失敗的主要因素之一 (Liange)。在家畜動(dòng)物的生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，高比例的妊娠失敗是由于子宮內(nèi)膜容受性的 (SpencerandHansen,2015)。因此，子宮內(nèi)膜容受性的健康與否，關(guān)系著動(dòng)立，對(duì)于養(yǎng)殖效益的保證至關(guān)重要。反芻動(dòng)物的子宮壁從功能上可以分為子宮內(nèi)膜和子宮肌層。成熟的子宮內(nèi)膜（LE）、腺上皮（GE）、基質(zhì)、血管和免疫細(xì)胞組成。子宮內(nèi)膜有兩個(gè)特征明：腺阜和腺體間區(qū)域。腺阜區(qū)域是表面附植位點(diǎn)和胎盤形成位置，，包含腔上皮基質(zhì) (Wimsatt,1950,AmorosoandRowlands,1951,Zhaoetal.,2018)。反芻動(dòng)物牛、山羊）妊娠的建立始于囊胚期，包括妊娠識(shí)別信號(hào)、附植和胎盤形成 (Imak, 2018)。

-2 綿羊子宮內(nèi)膜溶黃體機(jī)制的激素調(diào)控和孕體在子宮環(huán)境抗溶黃體作用的圖示(Spenc2015)igure 1-2 Schematic illustrating hormonal regulation of the endometrial luteolytic mechaniantiluteolytic effects of the conceptus on the ovine uterine endometrium(Spencer and Hansen, 20 孕酮調(diào)控子宮內(nèi)膜功能和孕體伸長(zhǎng)作用孕酮刺激和維持子宮內(nèi)膜功能對(duì)于孕體發(fā)育、附植、胎盤形成和發(fā)育是pencer et al., 2016b)。在早期妊娠牛體內(nèi)，孕酮濃度直接影響胚胎存活。度的增加促進(jìn)了肉牛、奶牛和綿羊的孕體伸長(zhǎng)，然而在黃體早期低劑量綿羊和牛的胚胎發(fā)育遲緩 (Lonerganetal.,2016)。在早期妊娠階段額外補(bǔ)胚胎成活的作用尚不確定，很有可能對(duì)于存在缺陷的高產(chǎn)奶牛胚胎并沒(méi)在牛和綿羊上，已經(jīng)證實(shí)了妊娠后提高孕酮濃度有利于孕體伸長(zhǎng)。研究 mg 孕酮從妊娠第 1 天開始處理，連續(xù)處理四天，增加了外周血漿孕酮濃
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S827

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本文編號(hào)：2699233