【摘要】：豬圓環(huán)病毒病是有豬圓環(huán)病毒2型引起的系統(tǒng)性免疫功能紊亂疾病。豬圓環(huán)病毒2型可分為2a,2b,2c和2d共4種基因亞型,其中2d亞型報道逐漸增多,基于PCV2a/PCV2b基因型疫苗對PCV2d保護(hù)效果成為需要關(guān)注問題。為此我們調(diào)查研究湖南省內(nèi)PCV2時間分布規(guī)律,疫苗田間有效性評估及抗體壓力下對PCV2-Cap蛋白氨基酸正向選擇作用,以期為PCV2疫苗免疫和更新提供指導(dǎo)和背景信息。本研究中建立了一種快速提取組織樣本、細(xì)胞培養(yǎng)物和血清中DNA的方法并進(jìn)行了評估。通過棋盤法優(yōu)化鹽酸胍和十二烷基磺酸鈉溶液濃度,最終確定鹽酸胍和十二烷基硫酸鈉溶液使用濃度分別為3M和10%,并與酚仿法對比。兩種方法所提取的DNA濃度和純度相近,對DNA進(jìn)行普通PCR和定量PCR分析,兩者無顯著差異。該方法操作過程均在同一離心管內(nèi)進(jìn)行,極大的降低了交叉污染機(jī)會,而且該方法操作簡便,可快速的檢測大量樣本,應(yīng)用于DNA病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查,為本實驗的后續(xù)研究提供了基礎(chǔ)。為了解湖南省內(nèi)PCV2流行性及分子遺傳變異趨勢,通過對Genbank內(nèi)收錄PCV2全基因組序列分析,設(shè)計可用于PCV2檢測及亞型鑒別診斷引物。應(yīng)用PCR方法檢測本實驗室收集于2006-2016年生豬病料樣本內(nèi)PCV2核酸,陽性樣本進(jìn)一步使用亞型分型引物鑒定。隨機(jī)選取部分核酸陽性樣本進(jìn)行全基因組測序,并與Genbank內(nèi)序列全基因組重組分析和進(jìn)化分析。2006-2016年11年間PCV2總檢出率62%,各年份檢出率介于36.8%-89.1%。PCV2a檢測結(jié)果為陰性;PCV2b陽性率介于31.4%-63.6%,2006-2016年呈逐年下降趨勢;PCV2d陽性率介于48.5%-80%,2006-2016呈逐年上升趨勢。2006-2007年P(guān)CV2b占優(yōu),但是2008年后PCV2d成為主要流行基因亞型。PCV2b/PCV2d混合感染2006-2008年間呈現(xiàn)小幅上升,隨后穩(wěn)定于10%左右(PCV2b同源性,PCV2d同源性)。54條實驗序列中有27.78%發(fā)生重組且均發(fā)生在ORF1區(qū)域。進(jìn)化分析顯示實驗序列中有26條為PCV2b,28條為PCV2d。為評估PCV2疫苗免疫效果,選擇不同免疫時長豬場內(nèi)不同年齡豬采樣并進(jìn)行PCV2抗體和病毒血癥檢測,對檢測為陽性的血清樣品進(jìn)行PCV2亞型分型檢測和病毒載量測定。2016年血清樣本中IgG陽性率陽性率抗體水平普遍高于2013年血清樣本。非免疫場內(nèi)PCV2核酸陽性率高于免疫場,免疫時間短的豬場核酸陽性率高于免疫時間長的豬場。2013年免疫場內(nèi)流行的基因亞型以PCV2d為主,而非免疫豬場則以PCV2b為主;2016年兩個未免疫豬場中一個以PCV2d為主要流行基因亞型,另一個豬場與2013年該豬場流行基因亞型一致,以PCV2b為主;免疫豬場均以PCV2d為主。兩個年份中均有兩個基因亞型混合感染現(xiàn)象。血清中病毒載量檢測結(jié)果顯示2016年未免疫豬場內(nèi)外觀正常豬血清中病毒載量較高(最高5.5×10~7copies/ml),而免疫3年左右豬場內(nèi)PCV2病毒含量比未免疫豬場病毒含量低(2000copies/ml),免疫5年以上豬場PCV2病毒載量最低(500copies/ml)。選擇來自于PCV2疫苗非免疫場和免疫場PCV2信號較強(qiáng)30份,擴(kuò)增ORF2基因并測序,將分離序列與ORF2各基因型參考序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析,結(jié)果PCV2b和PCV2d基因型的序列數(shù)量比例為11:19。收集來自于網(wǎng)絡(luò)的ORF2序列并將其分別整理為疫苗免疫前和疫苗免疫后2個數(shù)據(jù)集,每個數(shù)據(jù)集進(jìn)一步分為中國及其他主要養(yǎng)豬國家ORF2序列,并根據(jù)基因型分類整理。通過網(wǎng)絡(luò)DataMonkey軟件分別計算各數(shù)據(jù)集內(nèi)ORF2氨基酸陽性選擇位點,最終通過通過SWISS和PyMol模擬展示陽性位點所處位置。使用疫苗后PCV2-Cap氨基酸正選擇位點均增多,國內(nèi)數(shù)據(jù)由2個位點(位點89和151)增多至4個(位點90、121、191和215),國外數(shù)據(jù)由1個位點(位點191)增多至5個(位點30、63、122、186和234),疫苗使用加速了PCV2-ORF2氨基酸位點進(jìn)化;其中位于中和抗原表位區(qū)域的氨基酸變化(位點63、89、90和121),有可能影響疫苗免疫效力。結(jié)論:PCV2d基因亞型2008年已成為湖南豬群中普遍流行基因亞型;疫苗對PCV2b和PCV2d基因亞型毒株均具有保護(hù)作用,免疫可降低豬體內(nèi)病毒含量,降低帶毒豬散毒機(jī)會及降低豬群間病毒傳播頻率;長期堅持合理免疫程序和劑量,有可能完全清除豬群中病毒循環(huán);PCV2-ORF2編碼氨基酸在抗體壓力下發(fā)生正向選擇,而疫苗免疫加速正向選擇速度。氨基酸改變對疫苗有效性需要進(jìn)一步研究。
【圖文】：

1-1 PCV2 不同基因亞型 ORF1-ORF3 堿基定位及編碼氨基酸ocation of ORF1-3 in different genotype and number of amino acCV2a(1768) PCV2b (1767) PCV2c (1767) 組mic蛋白質(zhì)Protein基因組Genomic蛋白質(zhì)Protein基因組Genomic蛋白質(zhì)Proteintion aa NO. position aa NO. position aa NO95 314 51-995 314 51-995 314 1033 233 1733-1032 233 1734-1030 234 357 104 670-356 104 670-356 104 補(bǔ)連，表中各基因型使用的參考序列分別為 PCV2a：AF0553PCV2c：EU148504，PCV2d：HM038017。

4 年該團(tuán)隊又報道在野豬體內(nèi)檢測到 PCV2 核酸。此后在多個國家或地區(qū)的檢測結(jié)豬自然感染 PCV2 現(xiàn)象比較普遍[93-95]，并且在多種動物體內(nèi)可以檢到 PCV2 核酸[96-10用于 PCV2 感染實驗?zāi)Ｐ蛣游颷101, 102]，但是 PCV2 誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生病理變化常常不穩(wěn)定盡管在多種動物或蚊、蠅等昆蟲體內(nèi) PCV2 核酸檢測為陽性，但是病毒是否可在豬以哺乳動物或昆蟲體內(nèi)增殖，是否可導(dǎo)致相關(guān)疾病仍不十分清楚�？缭剿拗髡系K的現(xiàn)象毒均有報道[104, 105]，也是病毒進(jìn)化的一種方式[106, 107]。有報道在兒童輪狀病毒疫苗中CV2 核酸片段[108]，但是將疫苗接種于 PK15 細(xì)胞內(nèi)并檢測 PCV2 RNA 或相應(yīng)蛋白質(zhì)果為陰性，表明疫苗中的 PCV2 核酸片段不具有繁殖能力。目前還沒有 PCV2 感染人內(nèi)檢測到 PCV2 核酸的報道，由于 PCV2 感染后主要導(dǎo)致宿主免疫系統(tǒng)紊亂，因此如感染跨越宿主障礙，在多種動物間廣泛傳播，，將會造成極大危害。V2 流行性和遺傳進(jìn)化PCV2 流行性和傳播
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.651

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2699139