發(fā)布時(shí)間：2020-06-06 01:02

【摘要】：外泌體(exosomes)是一類能夠轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、脂質(zhì)和核酸等物質(zhì)的胞外雙層膜囊泡。病毒感染后,宿主細(xì)胞分泌的外泌體攜帶有病毒或宿主細(xì)胞活性成分,該外泌體參與調(diào)控病毒感染或者宿主免疫反應(yīng)。口蹄疫病毒(FMDV)感染后,宿主細(xì)胞分泌的外泌體在FMDV感染中的作用及機(jī)制尚不清楚。本研究以FMDV感染細(xì)胞釋放的外泌體(FMDV-exosomes)與未感染細(xì)胞釋放的外泌體(MOCK-exosomes)為研究對(duì)象,揭示FMDV-exosomes在FMDV感染中的作用及機(jī)制,主要內(nèi)容如下:1.FMDV-exosomes的分離鑒定及成分分析本研究使用FMDV(A/GDMM/CHA/2013)感染豬腎傳代細(xì)胞PK-15,收集感染細(xì)胞上清,使用差速離心結(jié)合免疫純化的方法分離純化FMDV-exosomes;使用蛋白質(zhì)免疫印跡(WB),透射電鏡(TEM)和動(dòng)態(tài)光散射(DLS)三種方法檢測(cè)分離純化產(chǎn)物,結(jié)果均符合外泌體定義,證實(shí)分離到該外泌體。將FMDV基因組分成7個(gè)片段,提取FMDV-exosomes中RNA,RT-PCR可以成功擴(kuò)增到7個(gè)片段,證明FMDV-exosomes中含有全長(zhǎng)FMDV核酸序列。使用液相二級(jí)質(zhì)譜(LC-MS/MS)鑒定FMDV-exosomes蛋白表達(dá)譜,共鑒定到1133個(gè)宿主蛋白和9個(gè)FMDV蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、2B、2C、3A、3C、3D);同時(shí)使用穩(wěn)定表達(dá)CD63-GFP的PK-15細(xì)胞株驗(yàn)證質(zhì)譜結(jié)果,發(fā)現(xiàn)綠色熒光(外泌體)中包裹有紅色熒光(FMDV-VP3),證明FMDV-exosomes中含有FMDV蛋白。2.FMDV-exosomes與FMDV感染使用DiO標(biāo)記(綠色)FMDV-exosomes,將其孵育PK-15細(xì)胞,共聚焦顯微鏡觀察到胞內(nèi)有綠色熒光,證明分離的FMDV-exosomes能夠進(jìn)入宿主細(xì)胞。將FMDV-exosomes接種PK-15和IBRS-2細(xì)胞,FMDV-exosomes均能使兩種細(xì)胞產(chǎn)生病變,且qRT-PCR能檢測(cè)到病毒復(fù)制,證明FMDV-exosomes能夠感染FMDV易感細(xì)胞。將FMDV-exosomes接種RAW264.7細(xì)胞,qRT-PCR檢測(cè)到病毒復(fù)制,證明FMDV-exosomes能夠侵染FMDV非易感細(xì)胞。使用FMDV中和抗體處理FMDV-exosomes,將其孵育PK-15細(xì)胞,FMDV-exosomes仍然能夠感染PK-15細(xì)胞,證明FMDV-exosomes感染細(xì)胞能力不受中和抗體影響。為進(jìn)一步驗(yàn)證FMDV-exosomes致病性,將FMDV-exosomes接種3日齡Balb/C乳鼠,48 h出現(xiàn)乳鼠死亡現(xiàn)象,且檢測(cè)到FMDV復(fù)制,證實(shí)FMDV-exosomes內(nèi)的FMDV成分能夠在體內(nèi)復(fù)制。3.FMDV-exosomes與FMDV復(fù)制使用BCA蛋白濃度檢測(cè)方法定量FMDV-exosomes與MOCK-exosomes總蛋白量,將等量樣品分別孵育PK-15細(xì)胞,接種FMDV,qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)孵育FMDV-exosomes組FMDV載量更低。使用si-Rab27a干擾宿主蛋白R(shí)ab27a(抑制外泌體分泌),接種FMDV,qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)胞外病毒載量均比對(duì)照組高;使用0、5、10μmol/L GW4869(抑制外泌體形成)處理細(xì)胞,接種FMDV,qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)胞外病毒載量均比對(duì)照組高,且呈劑量依賴性。上述結(jié)果證明FMDV-exosomes抑制FMDV復(fù)制,減少外泌體分泌量有利于FMDV復(fù)制。為探究FMDV-exosomes通過何種途徑抑制病毒復(fù)制,將FMDV-exosomes分別接種PK-15、Vero、RAW264.7細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)FMDV-exosomes在三種細(xì)胞上均能上調(diào)TNF-α轉(zhuǎn)錄。4.FMDV復(fù)制與外泌體釋放使用WB方法檢測(cè)FMDV感染組與未感染組外泌體標(biāo)志蛋白表達(dá)量,采用BCA蛋白濃度檢測(cè)方法定量外泌體總蛋白量,均發(fā)現(xiàn)FMDV感染組分離到的外泌體相比未感染組少,證明FMDV復(fù)制降低了外泌體分泌量。將FMDV接種PK-15細(xì)胞,結(jié)果證實(shí)隨著FMDV復(fù)制,宿主蛋白R(shí)ab27a降解增多;分別使用CQ、NH_4Cl、Z-VAD-FMD、MG132四種蛋白降解抑制劑處理PK-15,然后接種FMDV,發(fā)現(xiàn)CQ(抑制自噬溶酶體途徑)處理后,FMDV不能有效降解Rab27a;以上結(jié)果證明FMDV通過自噬溶酶體途徑降解Rab27a。WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Rab27a后再接種FMDV,外泌體分泌量沒有減少,證明FMDV通過降解Rab27a抑制外泌體分泌。同時(shí),WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Rab27a抑制了FMDV復(fù)制,說明FMDV通過抑制外泌體分泌從而促進(jìn)FMDV復(fù)制。過表達(dá)FMDV 12個(gè)編碼蛋白,發(fā)現(xiàn)FMDV-2C降解宿主蛋白R(shí)ab27a,且呈劑量依賴性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)FMDV-2C能夠降低外泌體分泌量。
【圖文】：

圖 1-1 FMDV 基因組示意圖（引自 Peter W. Mason et al 2003）Figure 1-1 Schematic representation of the FMDV genome (adapted from Peter W. Mason etal 2003)1.1.2 口蹄疫病毒致病機(jī)制最近的研究已經(jīng)證實(shí)，F(xiàn)MDV 在豬上偏好通過上消化道進(jìn)入（Fukai et al2015）。Alexandersen 等人報(bào)道在病毒感染后 24~48 h，豬只背腭軟腭和扁桃體中FMDV RNA 含量最高（Alexandersen et al 2001）。實(shí)驗(yàn)條件下通過物理隔離即可有效的阻止 FMDV 傳播，但直接接觸會(huì)造成豬群 FMDV 快速傳播（Pacheco and Mason2010, Stenfeldt et al 2016b）。FMDV 感染后，口咽的上皮組織是早期感染期間病毒復(fù)制的主要部位，之后，在水泡病變中（次級(jí)復(fù)制位點(diǎn)）發(fā)生大量病毒擴(kuò)增（Stenfeldt et al 2016a）（圖 1-2）。在豬上，，病毒血癥可以在自然或人為病毒感染后的 24 h 內(nèi)被檢測(cè)到，并且通過口咽途徑大量排出感染性病毒粒子。通常在病毒血癥發(fā)生后 24 h，能夠發(fā)現(xiàn)發(fā)燒、食欲不振、口鼻蹄等處水皰等臨床癥狀（Stenfeldt et al 2014）。

D 感染豬不同階段組織中病毒分布示意圖（引自 Carolina Stenfeldt e Schematic diagram of virus distribution in different stages of FMD in pifrom Carolina Stenfeldt et al 2016)疫病毒拮抗宿主天然免疫機(jī)制感染期間，病毒與宿主存在共同進(jìn)化的情況： 方面，宿主過激發(fā)炎癥反應(yīng)抑制病毒的增殖、擴(kuò)散；另 方面，病毒也力，但這 行為也要避免過度反應(yīng)，保證宿主細(xì)胞存活以便yen et al 2017）。與所有病原體 樣，機(jī)體能夠識(shí)別 FMDV 的 I 型和 III 型干擾素（IFN）反應(yīng)。同樣的，F(xiàn)MDV 也會(huì)通統(tǒng)的清除作用。這些方式（Medina et al 2018）包括：（1） IFN 的誘導(dǎo)表達(dá)；（2）抑制蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)；（3）阻斷先天免翻譯后修飾；（4）調(diào)節(jié)自噬相關(guān)通路；（5）抑制應(yīng)激顆粒疫細(xì)胞功能。-VP2 通過 HSPB1 激活自噬反應(yīng)（Sun et al 2018）；FMDV-VP
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2698892