【摘要】：腐敗梭菌(Clostridium septicum)在土壤等自然界環(huán)境中分布十分廣泛,是造成動(dòng)物和人類(lèi)惡性水腫病的主要病原體。該細(xì)菌感染羊后主要引發(fā)羊快疫,發(fā)病羊在2-3天內(nèi)迅速死亡,給我國(guó)畜牧行業(yè)帶來(lái)重大損失。因此,迫切需要建立一種針對(duì)羊快疫等腐敗梭菌病的早期診斷方法,以做到對(duì)臨床可疑發(fā)病樣品的快速篩查。腐敗梭菌最主要毒力因子為α毒素,該毒素具有溶血、致死和壞死等多種生物學(xué)活性,因此本研究以α毒素為主要研究對(duì)象,通過(guò)制備α毒素單克隆抗體及多克隆抗體,完成對(duì)雙抗體夾心ELISA(Double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA)檢測(cè)方法的初步探索,為羊快疫等腐敗梭菌病的早期臨床診斷提供技術(shù)支持。研究?jī)?nèi)容可分為以下三個(gè)部分:1、腐敗梭菌天然α毒素與重組毒素蛋白的制備將腐敗梭菌參考株(ATCC 12464)進(jìn)行菌種復(fù)蘇和增菌培養(yǎng)后,粗提腐敗梭菌天然蛋白,使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)對(duì)提純后的蛋白進(jìn)行驗(yàn)證,獲得大小為46 kDa的天然α毒素。根據(jù)NCBI上公布的腐敗梭菌α毒素的CDs區(qū)序列,擴(kuò)增α毒素基因,構(gòu)建腐敗梭菌α毒素原核表達(dá)系統(tǒng),并在最佳誘導(dǎo)條件下(菌液OD_(600nm)為0.4-0.6時(shí),向菌液中加入濃度為0.5 mmol/mL的IPTG,37℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)5 h)大量表達(dá)可溶性重組蛋白并純化,最終測(cè)得目的蛋白濃度為4.28 mg/mL。通過(guò)Western blot分析表明該蛋白具有良好的免疫原性,證明腐敗梭菌α毒素原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建成功。2、單克隆抗體及多克隆抗體的制備使用滅活后的重組α毒素蛋白免疫新西蘭大白兔,將獲得的陽(yáng)性血清利用抗原親和層析方法進(jìn)行純化,獲得純化后的多克隆抗體濃度為0.98 mg/mL,多克隆抗體對(duì)重組蛋白效價(jià)檢測(cè)結(jié)果為1:256000,對(duì)天然α毒素效價(jià)檢測(cè)結(jié)果為1:128000,通過(guò)SDS-PAGE及Western-blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)該多克隆抗體純度高,特異性良好。使用滅活后的重組α毒素蛋白免疫BALB/c小鼠,小鼠血清轉(zhuǎn)陽(yáng)后制備脾細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞融合,通過(guò)雜交瘤細(xì)胞篩選及亞克隆實(shí)驗(yàn),最終確定8株強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞株。通過(guò)穩(wěn)定性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有6株細(xì)胞可以穩(wěn)定分泌單克隆抗體,其中3E8、6B12和6F10細(xì)胞株對(duì)天然α毒素的識(shí)別能力較強(qiáng)。選取其中的兩株細(xì)胞3E8和6B12,分別腹腔注射免疫BALB/c小鼠,收集腹水并純化后,通過(guò)間接ELISA測(cè)得兩株單抗對(duì)重組蛋白效價(jià)檢測(cè)結(jié)果為1:256000,對(duì)天然α毒素效價(jià)檢測(cè)結(jié)果為1:128000,兩株單抗?jié)舛确謩e為2.27mg/mL和1.96 mg/mL,通過(guò)SDS-PAGE和Western-blot方法鑒定單抗純度及特異性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)制備的兩株單克隆抗體純度高,特異性良好。3、針對(duì)腐敗梭菌α毒素DAS-ELISA的初步建立為建立高效、靈敏的DAS-ELISA方法,探索最佳配對(duì)抗體及抗體工作濃度,本研究將多克隆抗體作為捕獲抗體,將單抗3E8和6B12分別作為檢測(cè)抗體,通過(guò)方陣滴定實(shí)驗(yàn),確定作為捕獲抗體的多克隆抗體的最佳工作濃度為1.25μg/mL,作為檢測(cè)抗體的單抗3E8的最佳工作濃度為0.5μg/mL。在優(yōu)化條件下驗(yàn)證該方法的特異性,結(jié)果表明該方法僅對(duì)腐敗梭菌重組α毒素和天然α毒素具有識(shí)別作用,與其他蛋白無(wú)交叉反應(yīng),特異性良好。本研究成功構(gòu)建了腐敗梭菌α毒素重組蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng),在最佳誘導(dǎo)條件下大量誘導(dǎo)表達(dá)可溶性的目的蛋白,并以α毒素重組蛋白為基礎(chǔ),成功制備出針對(duì)腐敗梭菌α毒素的特異性強(qiáng),穩(wěn)定性好的單克隆抗體及多克隆抗體。初步摸索出DAS-ELISA的最佳配對(duì)抗體及最佳抗體工作濃度,并驗(yàn)證了優(yōu)化后的DAS-ELISA的特異性。為家畜腐敗梭菌病的臨床診斷提供了技術(shù)方法,也為腐敗梭菌病疫苗和相關(guān)藥物的研發(fā)提供了技術(shù)支撐。
【圖文】：

1 電子顯微鏡觀察腐敗梭菌 (引自 Macfarlane et al., 20e 1 Transmission electron micrographs of a C. septicum swa人、馬、牛、綿羊、豬、犬、貓、雞等，傷感染可致人的氣性壞疽，馬、牛、羊、, 2012)，消化道內(nèi)源性感染可致牛、綿羊, 2017)。在土壤中發(fā)現(xiàn)的腐敗梭菌也是從，腐敗梭菌可以感染有肝吸蟲(chóng)寄生的宿主體中分離出來(lái)，，死亡綿羊的壞死肝臟中同四種外毒素，通過(guò)血清學(xué)研究和酶活性研的實(shí)體。它們包括致死和壞死毒素（α毒和巰基活化毒素或膿毒素（δ毒素）。而其菌產(chǎn)生。通過(guò)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、免疫熒光和

其中前31個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，是疏水性結(jié)構(gòu)。該毒素與嗜水氣單胞菌的氣溶素在結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性等方面類(lèi)似，同源度高達(dá)72%。α毒素結(jié)構(gòu)如圖2所示，對(duì)其功能位點(diǎn)研究表明，第398位的精氨酸是控制α毒素體外活化最關(guān)鍵位點(diǎn)，該位點(diǎn)是弗林蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)，前體毒素需要經(jīng)過(guò)弗林蛋白酶水解后才能夠形成活化形式(Gordon et al., 1997; 彭國(guó)瑞, 2013)。而靠近C端的第302-312位氨基酸是α毒素與糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）錨定蛋白的結(jié)合位點(diǎn)(Mukamoto et al., 2013)，雙親性跨膜結(jié)構(gòu)（第204-231氨基酸結(jié)構(gòu)）主責(zé)α毒素的造孔功能(Melton et al., 2004; Jody A. MeltonWitt et al., 2006)。此外，有研究表明，同時(shí)突變S189C和S238C兩位點(diǎn)后，會(huì)使α毒素失去細(xì)胞毒性(Shin et al., 2004)。腐敗梭菌能夠產(chǎn)生一種單一的致死因子α毒素。Bernheimer等于1944年首次描述了α毒素(Bernheimer, 1944)，后來(lái)Ballard等人對(duì)分離出的α毒素進(jìn)行了表征(Ballard et al.,1992)。腐敗梭菌α毒素是屬于細(xì)胞外毒素的氣溶素家族的一種成孔毒素。雖然成孔毒素由于對(duì)紅細(xì)胞的溶解作用而通常被認(rèn)為是一種溶血素
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S852.616.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2697640