【摘要】：口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的急性高度接觸性動物傳染病,主要感染豬、牛與羊等偶蹄動物,造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和社會影響。防控FMD仍然是每年我國動物防疫工作的首要任務(wù)。目前,我國對FMD主要采取疫苗免疫為主的綜合性防控措施,其中滅活疫苗應(yīng)用最為廣泛,但滅活疫苗在生產(chǎn)與使用過程中存在病毒逃逸的安全風(fēng)險,需要開發(fā)新型疫苗來應(yīng)對未來FMD的防控問題。其中表位疫苗是最具有潛力的FMD新型疫苗之一。2013年A型FMDV SEA/97-G2亞型毒株傳入我國后,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,為了進(jìn)一步探明當(dāng)前A型FMDV衣殼蛋白的主要抗原表位區(qū)及其免疫原性,原核表達(dá)了A型FMDV衣殼蛋白的主要抗原表位區(qū)并進(jìn)行了免疫效果評價,以期為A型FMDV表位疫苗的研究提供線索。根據(jù)已鑒定的FMDV A型毒株的主要抗原位點(diǎn),結(jié)合基因序列比對結(jié)果,選擇了當(dāng)前A型FMDV流行毒株的主要抗原位點(diǎn)區(qū):包括A/QH/CHA/2013的VP2 70~81位、118~140位,VP1G-H環(huán)131~157位、C末端188~212位;A/WH/CHA/09 FMDV VP1 43~48位,VP3 55~72位;以及非結(jié)構(gòu)蛋白3A中的T細(xì)胞表位和通用性T細(xì)胞表位,用于構(gòu)建免疫原分子。通過柔性Linker將各表位基因串聯(lián),在串聯(lián)基因的3'端融合了6個His標(biāo)簽,構(gòu)建了含多個抗原表位基因的原核表達(dá)載體pET28a-ANX2和pET28a-ANX3,其中pET28a-ANX2采用了氨基酸反向串聯(lián)的方式;通過SDS-PAGE電泳和Western blot鑒定目的蛋白ANX2和ANX3的表達(dá)。將ANX2和ANX3表位蛋白大量表達(dá)和純化后,與CpG-ODNs和ISA201乳化后免疫小鼠和豬,對目的蛋白誘導(dǎo)宿主體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平進(jìn)行了鑒定,并在免疫后28日用流行毒株對免疫豬進(jìn)行了攻毒試驗(yàn),評價疫苗的保護(hù)效力。研究結(jié)果表明,表位重組蛋白ANX2和ANX3表達(dá)形成包涵體,蛋白分子質(zhì)量分別約為41kDa和39 kDa,Western blot鑒定均能與A型FMDV陽性血清特異性反應(yīng);免疫小鼠和豬后能產(chǎn)生抗A型FMDV抗體,細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4也有明顯升高,攻毒后對豬有一定的保護(hù)作用;ANX2的免疫原性略高于ANX3,證明氨基酸反向串聯(lián)方式的串聯(lián)更有利于重組蛋白展示抗原表位,從而增強(qiáng)其免疫效果。本研究為A型FMDV表位疫苗的研究積累了數(shù)據(jù)。
【圖文】：

變的-C 末端(Gonzalez-Magaldi et al., 2015)。3A 蛋白含有疏水基，能夠介導(dǎo)胞膜結(jié)合，，促進(jìn)病毒進(jìn)入易感細(xì)胞(姚懷兵, 2017)。3A 或 3AB 蛋白的穩(wěn)定表復(fù)制，包括增加病毒空斑的形成和病毒滴度(Rosas M F., 2008)。研究表明和宿主范圍方面起著重要的作用，3A 蛋白中一些 aa 的替換和刪除會導(dǎo)致 F的改變(Beard., 2000)。FMDV 3ABC 蛋白可以用來區(qū)分豬和牛的感染與免疫開發(fā)了 3AB-ELISA 和 2C3AB-ELISA 用于凈化 FMDV(Lu et al., 2010)。3B組成，分別編碼 VPg（3B1）、VPg（3B2）、VPg（3B3），供價連接到基因 上，它可能是一個包裝信號，促進(jìn)完整病毒粒子的形成(劉慶軍, 2005)。3C蛋白的裂解，在許多小 RNA 病毒中（例如腸道病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒）3C點(diǎn)含有谷氨酰胺（Glutamine, Gln）殘基，但是 FMDV 3C 蛋白在其識別序 P1 區(qū)中含有包含谷氨酸（Glutamicacid, Glu）或 Gln 殘基的裂解位點(diǎn) (Krist蛋白是一種 RNA 聚合酶，在 FMDV 不同的血清型以及亞型之間是高度保守制合成過程中用于 RNA 的合成(Jeong., 2015)。而且，3D 蛋白還具有催化作其進(jìn)行 VPg 的尿苷酸化，具有 RNA 聚合酶和末端腺苷轉(zhuǎn)移酶的作用，分別 RNP 復(fù)合物來發(fā)揮作用(劉慶軍, 2005)。因此，3D 在 FMDV 的生命周期中

抗原表位的分類主要有兩種，根據(jù)抗原表位中氨基酸空間結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，構(gòu)象性表位；根據(jù) T、B 細(xì)胞所識別的抗原表位的不同可分為 B 細(xì)胞表原表位鑒定方法主要包括肽掃描技術(shù)、氨基酸定點(diǎn)突變技術(shù)、X-ray 技術(shù)以及噬菌體展示肽技術(shù)(文雪霞, 2012)。近年來隨著生物技術(shù)的發(fā)服了傳統(tǒng)方法耗時長、費(fèi)用高的缺點(diǎn)，能夠更便捷快速地鑒定抗原表位，A 型、O 型、C 型 FMDV 的核酸序列大約有 86%的序列相同，A 型類似于 O 型，這些為抗原表位的篩選提供了重要依據(jù)(Fry et al., 2005) O 型 FMDV 的抗原位點(diǎn) FMDV 至少有 5 個抗原位點(diǎn)。Fry 等總結(jié)了 O 型 FMDV 的抗原位點(diǎn)：和 C 末端，G-H 環(huán)是主要的抗原位點(diǎn)，能夠誘導(dǎo)高水平中和抗體，關(guān) 158 位，C 末端的關(guān)鍵 aa 是第 208 位；位點(diǎn) 2 位于 VP2 上的 BC 環(huán)和跨β-股的兩端，關(guān)鍵 aa 是第 70～73 位、75 位和 77 位，EF 環(huán)上的關(guān)；位點(diǎn) 3 位于 VP1 上的 BC 環(huán)上；位點(diǎn) 4 位于 VP3 的β-B‘結(jié)節(jié)’，；位點(diǎn) 5 位于 VP1 上，關(guān)鍵 aa 為第 149 位(Fry et al., 2005)。這些抗原擇提供了理論依據(jù)。如圖 1.2。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S852.4

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本文編號：2697691