【摘要】：雞傳染性喉氣管炎(Infectious laryngotracheitis,ILT)是由傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)所引起的急性呼吸道傳染病。該病具有傳播快,死亡率高,且能引起產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋率迅速下降等特點(diǎn),在我國(guó)有進(jìn)一步擴(kuò)大流行的趨勢(shì)。目前主要通過細(xì)胞或雞胚傳代致弱的弱毒活疫苗來(lái)預(yù)防本病,但弱毒活疫苗存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn),有的弱毒活疫苗還能使雞發(fā)病,引起ILT的爆發(fā)和流行。因此,急需研制開發(fā)出新一代高效安全的疫苗來(lái)防控ILT。雞痘病毒載體具有外源基因容量大,能產(chǎn)生針對(duì)外源基因的免疫應(yīng)答,宿主范圍窄,不會(huì)向環(huán)境中散毒以及能區(qū)分自然感染和免疫接種的動(dòng)物等獨(dú)特優(yōu)越性。因此,在本研究中,我們構(gòu)建了表達(dá)ILTV保護(hù)性抗原gB全長(zhǎng)或部分截短的3種重組雞痘病毒的轉(zhuǎn)移載體,分別以兩種雞痘病毒(Fowlpox virus,FPV)282E4株和LP株為母本毒株轉(zhuǎn)染獲得了 6種重組雞痘病毒,評(píng)價(jià)了其免疫效力,為針對(duì)ILTV的雞痘病毒載體疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。1.ILTV gB基因的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備根據(jù)GenBank發(fā)表的ILTV gB基因全長(zhǎng)序列,用DNAStar軟件分析其氨基酸序列的親水性、抗原性和表面可及性,選擇了兩段主要抗原區(qū)域,分別為861bp和972bp,擴(kuò)增后連接原核表達(dá)載體pET-32a(+)進(jìn)行原核表達(dá),獲得大小約為48kDa的gBa蛋白和51kDa的gBb蛋白,這兩種蛋白均為包涵體蛋白。純化蛋白免疫小鼠,獲得gBa和gBb多抗血清。Western-blot結(jié)果顯示這兩種血清具有良好的反應(yīng)性,能檢測(cè)LMH細(xì)胞中繁殖的ILTV,可用為gB蛋白表達(dá)檢測(cè)的抗血清。2.表達(dá)ILTV不同長(zhǎng)度gB基因的重組雞痘病毒的構(gòu)建利用點(diǎn)突變?cè)噭┖?同義突變了 gB基因上兩處與FPV轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列相吻合的位點(diǎn)。分別將ILTV gB全長(zhǎng)基因和兩個(gè)抗原性強(qiáng)的gB截短基因(gB1:439-1362bp;gB2:439-2094bp)克隆到雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體p12LS中,獲得轉(zhuǎn)移載體p12LS-gB、p12LS-gB1和p12LS-gB2,用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染已感染雞痘母本病毒wt-FPVLP和wt-FPV282E4的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF),利用藍(lán)白斑篩選,獲得純化的6種重組雞痘病毒rFPVLP-gB,rFPVLP-gB1,rFPVLP-gB2,rFPV282E4-gB,rFPV282E4-gB1 和 rFPV282E4-gB2。PCR 驗(yàn)證目的基因已成功插入雞痘病毒基因組;間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)和Western-blot試驗(yàn)證實(shí),gB基因在重組雞痘病毒載體中表達(dá)良好。3.表達(dá)ILTV不同長(zhǎng)度gB基因的重組雞痘病毒的免疫效力試驗(yàn)80只28日齡SPF雞隨機(jī)分成8組,每組10只,于頸部皮下免疫rFPVLP-gB、rFPVLP-gB2、rFPV282E4-gB、rFPV282E4-gB2、wt-FPVLP和 wt-FPV282E4,劑量為 105PFU/只;同時(shí)設(shè)商品化ILTV重組雞痘病毒基因工程疫苗對(duì)照組,劑量為105PFU/只;PBS對(duì)照組,劑量為0.2 mL/只。免疫后21d,用105EID50/只的ILTV的野毒株119株喉頭攻毒,觀察各疫苗對(duì)雞的免疫保護(hù)效果,并采集喉拭子測(cè)定排毒情況。結(jié)果表明,rFPVLP-gB和rFPV282E4-gB病毒組的保護(hù)率均為100%,高于商品化疫苗組的83.3%,而rFPVLP-gB2和rFPV282E4-gB2病毒組的保護(hù)率分別為33.3%和16.7%,低于商品化rFPV基因工程疫苗;排毒結(jié)果顯示所有疫苗組均排毒。綜上所述,在構(gòu)建的6株rFPVs中,ILTV gB全長(zhǎng)基因的表達(dá)及免疫效果最好,可作為ILTV的疫苗候選株。
【圖文】：

圖１－３邋ｐＥＴ３２ａ－ｇＢｂ的及Ｉ＋Ｊｔｏ邋Ｉ雙酶切鑒定逡逑－－＋

圖１－２邋ｐＥＴ３２ａ－ｇＢａ的及１＋Ａ７？ｏ邋Ｉ雙酶切鑒定逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.65

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 金明蘭;金寧一;魯會(huì)軍;馬鳴瀟;鄭敏;;雞痘病毒在哺乳細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的研究[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2013年03期

2 金明蘭;魯會(huì)軍;馬鳴瀟;鄭敏;劉慧娟;金寧一;;重組雞痘病毒對(duì)豬體的生物安全性研究[J];中國(guó)病原生物學(xué)雜志;2009年11期

3 金明蘭;金寧一;魯會(huì)軍;馬鳴瀟;鄭敏;劉慧娟;李旭;計(jì)越;霍小偉;唐樹勛;;重組雞痘病毒對(duì)豚鼠的生物安全性[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2007年06期

4 趙懷龍,金寧一,郭志儒,張茂林,夏志平,李萍;表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白的重組雞痘病毒的構(gòu)建和鑒定[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2004年01期

5 江文正,金寧一,李子健,張立樹,張洪勇;共表達(dá)HIV-1 gag-gp120與IL-6重組雞痘病毒和核酸疫苗的聯(lián)合免疫研究[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2004年03期

6 和鈺,張以芳;禽用重組雞痘病毒活載體疫苗研究及其應(yīng)用[J];中國(guó)家禽;2004年S1期

7 顧萬(wàn)鈞，，金寧一;雞痘病毒載體研究進(jìn)展[J];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);1995年04期

8 辛舒;田明堯;曹佳媛;薛斐;杜壽文;譚鵬;肖朋朋;陳興;郭海寧;金寧一;;表達(dá)基因Ⅶ型新城疫病毒F蛋白的重組雞痘病毒的構(gòu)建和篩選[J];中國(guó)獸醫(yī)科學(xué);2015年03期

9 張?bào)w銀;孫蕾;劉武杰;劉秀梵;;表達(dá)新城疫病毒F基因重組雞痘病毒的遺傳穩(wěn)定性[J];中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào);2006年04期

10 徐春厚,吳凌,房秀云,邵紅,程葛;雞痘病毒自然分離株的某些特性[J];中國(guó)獸醫(yī)科技;1996年11期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 邵衛(wèi)星;彭大新;盧建紅;韋棟平;劉玉良;劉秀梵;;表達(dá)雞白細(xì)胞介素2重組雞痘病毒的構(gòu)建及其體外表達(dá)產(chǎn)物生物活性的檢測(cè)[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)成立20周年慶典暨第十次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（下）[C];2003年

2 錢鶯娟;張雪蓮;陳德勝;陳溥言;;不同方式表達(dá)馬立克氏病病毒糖蛋白B重組雞痘病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體的構(gòu)建[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2002年

3 賈雷立;金寧一;王瑞琳;田明堯;陳義峰;魯會(huì)軍;金洪濤;鄭敏;;流感復(fù)合多表位重組雞痘病毒活載體疫苗的構(gòu)建及小鼠實(shí)驗(yàn)免疫研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第六屆理事會(huì)第二次會(huì)議暨教學(xué)專業(yè)委員會(huì)第六屆代表大會(huì)論文集[C];2006年

4 石星明;王云峰;王玫;蘭德松;孫妍;曾偉偉;童光志;;雞傳染性支氣管炎重組雞痘病毒基因工程疫苗免疫產(chǎn)生期的研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十四次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

5 金明蘭;金寧一;魯會(huì)軍;馬鳴瀟;鄭敏;李昌;計(jì)越;;重組雞痘病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會(huì)暨中國(guó)免疫學(xué)會(huì)獸醫(yī)免疫分會(huì)第七次研討會(huì)論文集[C];2008年

6 鄭敏;金寧一;李昌;劉棋;魯會(huì)軍;馬鳴瀟;金明蘭;霍曉偉;;口蹄疫重組雞痘病毒活載體疫苗在豚鼠、豬體內(nèi)免疫原性的研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第六屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨第11次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2005年

7 吳橋興;佘銳萍;胡鳳姣;安俊卿;郝文卓;;雞血抗菌肽對(duì)雞痘病毒的體外抑制作用[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)病理學(xué)分會(huì)、中國(guó)病理生理學(xué)會(huì)動(dòng)物病理生理專業(yè)委員會(huì)、中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)病理學(xué)專業(yè)委員會(huì)2016年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2016年

8 郭建順;金寧一;夏志平;金擴(kuò)世;徐敬龍;賈雷立;王凱;;重組雞痘病毒生物安全性評(píng)價(jià)的PCR方法的建立[A];人畜共患傳染病防治研究新成果匯編[C];2004年

9 金寧一;劉毅;郭志儒;方厚華;古長(zhǎng)慶;羅坤;夏志平;;IBDV VP2/VP0基因在重組雞痘病毒中的表達(dá)及實(shí)驗(yàn)免疫研究[A];第四屆中國(guó)畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2001年

10 金明蘭;金寧一;魯會(huì)軍;馬鳴瀟;鄭敏;劉慧娟;;口蹄疫重組雞痘病毒活載體疫苗vUTAL3CP1的構(gòu)建與遺傳穩(wěn)定性研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第六屆理事會(huì)第二次會(huì)議暨教學(xué)專業(yè)委員會(huì)第六屆代表大會(huì)論文集[C];2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 韋棟平;共表達(dá)新城疫病毒融合蛋白基因和H9亞型禽流感病毒血凝素基因的重組雞痘病毒及其免疫效力[D];揚(yáng)州大學(xué);2004年

2 邵衛(wèi)星;分別表達(dá)雞白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素2和骨髓單核細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因重組雞痘病毒的構(gòu)建及其對(duì)ND疫苗免疫效力的影響[D];揚(yáng)州大學(xué);2004年

3 沈國(guó)順;PRRSV、PCV2基因工程疫苗的構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)免疫研究[D];吉林大學(xué);2007年

4 金明蘭;口蹄疫病毒基因重組雞痘病毒活載體疫苗系統(tǒng)鑒定研究[D];吉林大學(xué);2007年

5 張紹杰;表達(dá)傳染性喉氣管炎病毒gB基因重組雞痘病毒的構(gòu)建及其免疫效力的研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2000年

6 彭大新;表達(dá)雞馬立克氏病病毒糖蛋白B基因及共表達(dá)糖蛋白B和雞γ干擾素基因的重組雞痘病毒的構(gòu)建及其免疫保護(hù)作用[D];揚(yáng)州大學(xué);2001年

7 程堅(jiān);表達(dá)和共表達(dá)H9亞型禽流感病毒血凝素基因和雞Ⅱ型干擾素基因的重組雞痘病毒[D];揚(yáng)州大學(xué);2001年

8 夏志平;共表達(dá)NDV F、IBDV VP0基因的重組雞痘病毒構(gòu)建及其實(shí)驗(yàn)免疫研究[D];中國(guó)人民解放軍軍需大學(xué);2002年

9 吳艷濤;新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因和表達(dá)該基因的重組雞痘病毒[D];揚(yáng)州大學(xué);2000年

10 陳志琳;表達(dá)馬立克氏病病毒gl基因重組雞痘病毒的構(gòu)建及其免疫保護(hù)作用[D];揚(yáng)州大學(xué);2002年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 他蕾;表達(dá)雞傳染性喉氣管炎病毒不同長(zhǎng)度的gB基因重組雞痘病毒的構(gòu)建及其免疫效力評(píng)價(jià)[D];揚(yáng)州大學(xué);2019年

2 王曼曼;雞痘病毒E3泛素連接酶基因ORF150編碼蛋白與泛素相互作用的初步研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2018年

3 邵二波;雞痘病毒地方分離株的鑒定及致病性研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

4 李霄;重組雞痘病毒腫瘤治療性疫苗的構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)免疫研究[D];吉林大學(xué);2005年

5 夏曉莉;表達(dá)雞傳染性喉氣管炎強(qiáng)毒gB基因的重組雞痘病毒的構(gòu)建及其免疫效力[D];揚(yáng)州大學(xué);2006年

6 田占成;表達(dá)傳染性支氣管炎病毒S1基因重組雞痘病毒的構(gòu)建及其免疫保護(hù)效力的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

7 劉存霞;共表達(dá)IBDV VP0、VP2基因的重組雞痘病毒構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)免疫研究[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2009年

8 張浩;豬瘟病毒E0-E2基因重組雞痘病毒遺傳穩(wěn)定性和免疫劑量研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2008年

9 徐敬龍;共表達(dá)NDVF、IBDV VP0基因重組雞痘病毒生物學(xué)特性研究[D];吉林大學(xué);2005年

10 郭建順;雞痘病毒分子生物學(xué)檢測(cè)方法的建立及其致病機(jī)理研究[D];吉林大學(xué);2005年

本文編號(hào)：2695243