【摘要】：田鼠巴貝斯蟲是一種重要的經(jīng)硬蜱傳播的頂復(fù)門紅細(xì)胞專性寄生蟲。多感染小型嚙齒類動(dòng)物,也可感染人。健康人感染田鼠巴貝斯蟲后往往無明顯臨床癥狀,但是免疫功能喪失的個(gè)體(如脾臟摘除患者,艾滋病患者)和免疫力低下的人群可能會(huì)引發(fā)嚴(yán)重感染,繼而引起由呼吸窘迫或貧血引起的腎功能衰竭,嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致死亡。田鼠巴貝斯蟲在感染宿主時(shí)通過裂殖生殖進(jìn)行無性繁殖,裂殖子裂解后會(huì)入侵更多的紅細(xì)胞從而對(duì)宿主循環(huán)系統(tǒng)造成損害。在這個(gè)過程中,田鼠巴貝斯蟲會(huì)分泌一些抗原,這些抗原使得蟲體可以有效地識(shí)別宿主紅細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行黏附、入侵等一系列行為。因此,篩選出裂殖子時(shí)期重要的分泌蛋白對(duì)于探究田鼠巴貝斯蟲入侵和致病機(jī)制具有重要意義。而篩選、鑒定分泌抗原的一個(gè)重要前提是蟲體的體外培養(yǎng),本課題從建立田鼠巴貝斯蟲的體外培養(yǎng)方法入手,通過質(zhì)譜分析田鼠巴貝斯蟲高豐度分泌抗原,并對(duì)其中兩個(gè)進(jìn)行功能研究。具體如下:1.田鼠巴貝斯蟲體外培養(yǎng)方法的建立本研究首先建立了田鼠巴貝斯蟲體外培養(yǎng)的方法。對(duì)HL-1培養(yǎng)基與1640培養(yǎng)基進(jìn)行比較,結(jié)果表明二者并無明顯差異。但是從換液及對(duì)血清要求來說使用1640培養(yǎng)基要求新鮮宿主血清,實(shí)驗(yàn)小鼠需求量大,而HL-1可使用商品化胎牛血清,故最終確定使用HL-1培養(yǎng)基。2.田鼠巴貝斯蟲分泌抗原的篩選使用無血清體系培養(yǎng)田鼠巴貝斯蟲,分別收取不同時(shí)間段的培養(yǎng)上清進(jìn)行蛋白質(zhì)液相色譜質(zhì)譜分析(LC-MS/MS),結(jié)果一共篩選到40種蛋白,通過生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)兩種表達(dá)豐度較高的蛋白SA1與GPI10。此兩種蛋白為GPI家族蛋白,具有錨定在蟲體表面的特點(diǎn),故選擇GPI10與SA1進(jìn)行研究。3.田鼠巴貝斯蟲SA1與GPI10的功能鑒定首先對(duì)SA1與GPI10進(jìn)行截短表達(dá)片段的擴(kuò)增,構(gòu)建含GST標(biāo)簽的pGEX-6p-1-SA1與pGEX-6p-1-GPI10原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化入BL21與Transetta大腸桿菌后分別進(jìn)行表達(dá),分別從上清與包涵體得到了純化后的SA1與GPI10重組蛋白。Western blot分析表明rSA1與rGPI10可以被田鼠巴貝斯蟲的BALB/c鼠陽性血清特異性識(shí)別,證明其具有很好的反應(yīng)原性。隨后分別進(jìn)行了鼠源與兔源多克隆抗體的制備,對(duì)這兩種基因的天然蛋白存在形式進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)SA1與GPI10既存在于蟲體裂解物中,也存在于染蟲紅細(xì)胞裂解物中。間接免疫熒光試驗(yàn)表明SA1在田鼠巴貝斯蟲裂殖子時(shí)期大量表達(dá),且在蟲體膜和胞質(zhì)內(nèi)均能檢測到SA1的熒光信號(hào),在激光掃描共聚焦顯微鏡下可觀察到SA1被大量分泌至胞外;相比之下GPI10胞質(zhì)內(nèi)和整體表達(dá)量均偏少,且主要分布在蟲體膜表面;SA1與GPI10共定位表明,二者在蟲體膜上的熒光具有部分重疊,存在部分共定位。紅細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)表明SA1與GPI10的重組蛋白具有黏附紅細(xì)胞的能力,并且黏附量與蛋白量成正比,表明二者均為離子型黏附;紅細(xì)胞花環(huán)試驗(yàn)結(jié)果表明SA1蛋白在HEK293T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后會(huì)通過其GPI錨結(jié)構(gòu)定位在細(xì)胞表面,并且這些SA1蛋白會(huì)黏附住宿主紅細(xì)胞形成明顯的花環(huán)。由此推測這兩種蛋白可能對(duì)蟲體入侵紅細(xì)胞起著十分重要的作用;抗體中和試驗(yàn)結(jié)果表明SA1與GPI10的多克隆抗體均能抑制蟲體生長,抗體濃度分別在0.24 mg/mL和0.2 mg/mL時(shí)與對(duì)照組差異極顯著。綜合以上,本研究成功建立了田鼠巴貝斯蟲短期連續(xù)體外培養(yǎng)方法,通過質(zhì)譜及生物信息學(xué)篩選出SA1與GPI10兩種分泌蛋白,通過間接免疫熒光、紅細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)、花環(huán)試驗(yàn)及抗體中和試驗(yàn)對(duì)二者進(jìn)行了功能鑒定,對(duì)深入探討田鼠巴貝斯蟲入侵宿主的分子機(jī)制及對(duì)田鼠巴貝斯蟲病的免疫預(yù)防研究具有重要意義。
【圖文】：

圖 1-1 田鼠巴貝斯蟲的傳播方式(Vannier et al 2015)Fig. 1-1 Transmission of B. microti田鼠巴貝斯蟲大多數(shù)情況下經(jīng)丹敏硬蜱傳播，極少數(shù)情況下會(huì)tblade et al 2017)。在美國，田鼠巴貝斯蟲的主要保蟲宿主（reservoir 足鼠（white-footed mice），人是偶見宿主（incidental hosts）。成年未攜帶田鼠巴貝斯蟲的雌性蜱蟲會(huì)在春季進(jìn)行產(chǎn)卵，，此為第一vae）會(huì)在第一年夏初孵化，并在夏末從受感染的白足鼠身上吸食血液貝斯蟲。此時(shí)為田鼠巴貝斯蟲的有性生殖階段，配子體進(jìn)入幼蜱的腸殖，大小配子體進(jìn)行融合形成二倍體合子。二倍體合子分裂后產(chǎn)生單倍單倍體合子移動(dòng)到蜱的唾液腺等其他器官中形成動(dòng)合子，動(dòng)合子最終化發(fā)育成為子孢子。幼蜱在第二年春天蛻皮從而成長為若蜱（nymph，若蜱叮咬鼠或者人時(shí)，其唾液腺中的子孢子會(huì)進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，該階斯蟲無性生殖階段，子孢子入侵紅細(xì)胞后會(huì)分化成滋養(yǎng)體，而后發(fā)育為到一定數(shù)量后，紅細(xì)胞會(huì)裂解，蟲體釋放，再次入侵新的紅細(xì)胞，如

圖 1-2 瘧原蟲裂殖子 3D 超微結(jié)構(gòu)(Bannister et al 2000)Fig. 1-2 Three-dimensional organization of a Plasmodium falciparum merozoite頂復(fù)亞門有包括如瘧原蟲、弓形蟲、隱孢子蟲等在內(nèi)的對(duì)公共衛(wèi)生安全存在嚴(yán)威脅的原生動(dòng)物。巴貝斯蟲作為頂復(fù)亞門原蟲中的一員，其在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上擁有其他頂復(fù)門原蟲類似的細(xì)胞器，如頂質(zhì)體、微線體、棒狀體及致密顆粒（巴貝斯中為球狀體）等(DelCarmenTerronetal2016)，這些相似的生物學(xué)結(jié)構(gòu)決定了蟲體侵宿主時(shí)存在相對(duì)保守的機(jī)制。在巴貝斯蟲領(lǐng)域中牛巴貝斯蟲的入侵機(jī)制研究最透徹，牛巴貝斯蟲在裂殖子時(shí)期入侵宿主的紅細(xì)胞時(shí)，首先會(huì)對(duì)紅細(xì)胞產(chǎn)生黏附，后進(jìn)行特異位點(diǎn)識(shí)別使得蟲體的頂端立即再定位至紅細(xì)胞膜上，同時(shí)蟲體會(huì)分泌RAP(何軍偉 2017)、AMA1、RAP1(張文杰 2012)等抗原定位在蟲體表面而后使蟲相關(guān)蛋白與紅細(xì)胞表面受體形成緊密連接復(fù)合物，介導(dǎo)蟲體的入侵。隨著蟲體進(jìn)宿主紅細(xì)胞，紅細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷，在蟲體四周構(gòu)成納蟲泡，之后蟲體分泌 SBPs 改變細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，從而內(nèi)化宿主細(xì)胞，使得蟲體可以在其中進(jìn)行增殖(張慶麗 2012)，此完成整個(gè)入侵過程(Yokoyama et al 2006)。這五個(gè)階段便成為了目前廣為認(rèn)可的貝斯蟲入侵宿主的模式階段。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S852.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊萬蓮,夏兆飛,李伊立;犬巴貝斯蟲病的診治[J];中國獸醫(yī)雜志;2004年10期

2 趙俊龍,劉鐘靈;巴貝斯蟲體外培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J];中國獸醫(yī)寄生蟲病;1997年04期

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1 何軍偉;東方巴貝斯蟲TRAP2基因的克隆表達(dá)及其部分功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

2 張文杰;東方巴貝斯蟲棒狀體相關(guān)蛋白1（RAP1）基因克隆及免疫特性研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

3 張慶麗;牛紅細(xì)胞表面受體糖蛋白和東方巴貝斯蟲球狀體蛋白3基因的克隆表達(dá)及分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2695508