【摘要】：背景與目的:牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea,BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的牛的一種重要疾病。牛病毒性腹瀉病毒基因亞型眾多,且新的亞型不斷的出現(xiàn),這使得臨床防控BVDV更加困難;而BVDV進(jìn)入細(xì)胞利用的受體和引起的免疫反應(yīng)仍沒有研究清楚,故無法研究針對靶點的的抗病毒藥物。本研究通過對BVDV基因組序列分析和其侵染機(jī)制的研究,可以為防控BVDV提供理論支持,為新型抗BVDV治療靶點的設(shè)計奠定基礎(chǔ)。方法:將臨床分離的BVDV病毒BJ1201、BJ1305和BJ1308在牛腎上皮(MDBK)細(xì)胞上進(jìn)行大量擴(kuò)繁,并提取病毒RNA,對病毒RNA進(jìn)行全基因組測序;利用生物信息學(xué)方法測序分析臨床分離株全基因組的特點,并與NCBI數(shù)據(jù)庫的BVDV的典型毒株進(jìn)行比對,深入分析其遺傳進(jìn)化關(guān)系。利用BVDV標(biāo)準(zhǔn)株NADL和臨床分離株BJ1305分別感染MDBK細(xì)胞,于不同時間點分別提取細(xì)胞的總RNA和蛋白。并利用poly I:C激活RIG-Ⅰ評價該通路對病毒復(fù)制的影響。使用定量Real-time PCR對感染病毒后不同時間的低密度脂蛋白受體(LDLR))、CD46、RIG-Ⅰ、TLR-3/TLR-7、干擾素調(diào)控因子3(IRF-3)和IFN-α/β在基因水平上進(jìn)行定量;并應(yīng)用Western blot分別檢測其LDLR、CD46、RIG-Ⅰ和BVDVE2蛋白水平的變化。為了深入研究LDLR在BVDV侵染MDBK細(xì)胞過程中的作用,我們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)將MDBK細(xì)胞的LDLR敲除。構(gòu)建pCRISPR-LDLR-sg5質(zhì)粒,與pCRISPR-W9和pCAG-Pbase敲除系統(tǒng)共同電轉(zhuǎn)染入MDBK細(xì)胞;利用測序和Western blot鑒定LDLR敲除的單克隆細(xì)胞;最后利用LDLR-/-的MDBK細(xì)胞進(jìn)行BVDV侵染試驗,用免疫熒光和Western blot等方法評價LDLR缺失對BVDV侵染MDBK細(xì)胞的影響。結(jié)果:分別根據(jù)BVDV全基因組、5'-UTR和Npro基因片段所構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹表明三株BVDV臨床分離株為BVDV-1d亞型;利用BVDV標(biāo)準(zhǔn)株NADL和臨床分離株BJ1305進(jìn)行試驗,結(jié)果顯示:BVDV標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株24 h可以顯著上調(diào)MDBK細(xì)胞的膜上受體LDLR和CD46的表達(dá),且可以顯著激活MDBK細(xì)胞的RIG-Ⅰ模式識別受體,抑制TLR-3/TLR-7模式識別受體,顯著下調(diào)IRF-3轉(zhuǎn)錄水平;且polyⅠ:C激活RIG-1后可抑制CPBVDV復(fù)制,而對NCP的復(fù)制的影響差異不顯著;細(xì)胞病變型(CP)BVDV NADL可以誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型IFN(IFN-β),而非細(xì)胞病變型(NCP)BVDV BJ1305則顯著抑制Ⅰ型IFN(IFN-α/IFN-β)的產(chǎn)生,逃避宿主免疫。成功敲除了 MDBK細(xì)胞的LDLR,LDLR缺失的MDBK細(xì)胞在感染病毒后24 h和36 h檢測到微弱的病毒蛋白表達(dá),而野生型細(xì)胞在感染后24 h和36 h則有明顯的病毒蛋白印跡。結(jié)論:臨床分離的三株BVDV均屬于BVDV-1d亞型。BVDV利用MDBK細(xì)胞膜表面受體LDLR、CD46誘導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞,且LDLR是BVDV進(jìn)入MDBK細(xì)胞利用的主要受體:在胞內(nèi)BVDV可以被RIG-Ⅰ模式識別受體識別,抑制TLR-3/TLR-7模式識別受體;CPBVDV可以誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型IFN,NCP BVDV抑制Ⅰ型IFN的產(chǎn)生而逃避宿主免疫。
【圖文】：

圖１－１瘟病毒逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓｅｓ逡逑（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ邋ｏｆ邋Ｖｉｒｏｌｏｇｙ邋ａｎｄ邋Ｃｅｌｌ邋Ｂｉｏｌｏｇｙ邋ｉｎ邋Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ邋ｏｆ邋Ｌｉｉｂｅｃｋ）逡逑．１邋ＢＶＤＶ基因組成和編碼蛋白逡逑病毒編碼的蛋白由病毒的生物型決定：ＣＰ分離株包含蛋白Ｐ８０和Ｐ１２５，然而ＮＣＰ２５蛋白。ＢＶＤＶ的基因組擁有一個巨大的^u放性編碼框，能編碼由３８９８個氨基酸組成和非結(jié)構(gòu)蛋白，約４３８邋ｋＤ的多聚蛋白。病毒的１１－１２個多聚蛋白己被鑒定，而ＣＰ分個或多種多聚蛋白。多聚蛋白在宿主和病毒蛋白酶共同作用下經(jīng)過翻譯和翻譯后過程白：Ｎｐｆ°，Ｃ，Ｅｍｓ，，邋Ｅｌ，Ｅ２，邋ｐ７，邋ＮＳ２－ＮＳ３邋（ＣＰ型則分解為兩個蛋白，ＮＣＰ型則不４Ａ，邋ＮＳ４Ｂ，邋ＮＳ５Ａ，和邋ＮＳ５Ｂ１１．５’７１。逡逑Ｎｐｒｃ／Ｐ２０蛋白是０ＲＦ編碼的第一個蛋白產(chǎn)物。該蛋白由１６８個氨基酸組Ｓ－ＰＡＧＥ中分析發(fā)現(xiàn)其為保守的２０邋ｋＤ。它具有木瓜樣蛋白酶活性，在多聚蛋白的Ｃ端子內(nèi)剪切，首先從新生的多聚蛋白上釋放出來。Ｎｐｒｏ繼續(xù)將多聚蛋白剪切變成其他的非結(jié)構(gòu)蛋白。病毒的木瓜樣蛋白酶活性在病毒復(fù)制過程中的功能主要體現(xiàn)在，生成Ｃ蛋白，以及特異性的阻斷丨ＲＦ３的活性。ＩＲＦ－３，即干擾素調(diào)控因子３邋（邋ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ邋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文邐第一章前言逡逑擬定的邋ＲＮＡ邋依賴的邋ＲＮＡ邋聚合酶（ＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ＲＮＡ邋ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，邋ＲＤＲＰ）活性丨４Ｍ４］。它是邋ＢＶＤＶ逡逑半衰期最短的蛋白，且沒有針對該蛋白的特異性血清抗體可被檢測到［４－＇逡逑，＇
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S852.653

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2694201