【摘要】：牦牛(Bos grunniens)生活在海拔3000~5000 m的高原地區(qū),是該地區(qū)的重要畜種之一。據(jù)報道,高海拔地區(qū)年平均氣溫在-3~-5°C的范圍內(nèi);相比海平面年平均氣溫(16.5~23.1°C),高原地區(qū)表現(xiàn)出氣溫低下的特點。皮膚是直接接觸外界環(huán)境的器官,其附屬物毛囊在寒冷季節(jié)產(chǎn)絨,且產(chǎn)生的毛纖維具有很強的防濕能力,有利于牦牛生活在高寒地區(qū)。因此,為探索轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor,TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone morphogenetic protein 2,BMP2)和性激素相關(guān)蛋白對牦牛毛囊周期的調(diào)控特征。本試驗以成年雄性牦牛為研究對象,分別采集毛囊休止期、生長早期、生長中期、生長晚期和退行期5個不同生長時期的皮膚樣本,進行了以下3個方面的研究:(1)TGF-β和熱休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)是調(diào)控毛囊從生長期-退行期轉(zhuǎn)換的重要因子。為了檢測TGF-β和HSP70是否參與調(diào)控牦牛皮膚毛囊從生長期-退行期的轉(zhuǎn)換。本試驗采用免疫組織化學(xué)、免疫熒光、實時熒光定量PCR(qRT-PCR)以及Western blotting等方法,對毛囊生長中期、生長晚期和退行期皮膚樣本中TGF-β、Ⅱ型TGF-β受體(Transforming growth factor receptorⅡ,TGF-βRⅡ)、Casepase-3以及HSP70的表達進行檢測。結(jié)果顯示,TGF-β2 mRNA在毛囊不同時期皮膚內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于TGF-β1和TGF-β3mRNA轉(zhuǎn)錄水平;同時,TGF-β2、TGF-βRⅡ及Caspase-3蛋白在毛囊退行期皮膚內(nèi)的表達高于生長中期;并且免疫熒光雙染結(jié)果顯示,退行期毛囊的部分TGF-βRⅡ陽性細胞呈現(xiàn)TUNEL陽性。HSP70在生長中期的表達高于生長晚期和退行期,且HSP70的最低和最高表達水平與Caspase-3相反。結(jié)果表明,TGF-β2在牦牛毛囊退行期的誘導(dǎo)中發(fā)揮重要作用,并且其可能通過TGF-βRⅡ的介導(dǎo)途徑來誘導(dǎo)毛囊上皮細胞凋亡;相反,HSP70可能通過保護細胞免受凋亡來調(diào)控牦牛毛囊向退行期轉(zhuǎn)換。綜上所述,TGF-β2和HSP70在牦牛毛囊退行期發(fā)生過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。(2)BMP2、ⅠA型骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體(Bone morphogenetic protein receptorⅠA,BMPR-ⅠA)及Noggin是參與毛囊休止期-生長期轉(zhuǎn)換的重要蛋白。為了探索BMP2、BMPR-ⅠA和Noggin在牦牛毛囊不同時期皮膚內(nèi)的表達特征,本試驗采用qRT-PCR、Western blotting和免疫組織化學(xué)法,對毛囊休止期、生長早期和生長中期皮膚中BMP2、BMPR-ⅠA及Noggin基因和蛋白的表達進行了檢測。qRT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示BMP2及BMPR-ⅠA在毛囊休止期皮膚中的表達最高,而Noggin的最高表達出現(xiàn)在生長早期;并且從休止期到生長早期階段,BMP2及BMPR-ⅠA的表達呈下調(diào)趨勢,而Noggin的表達呈上調(diào)趨勢。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示BMP2、BMPR-ⅠA和Noggin分別表達于皮膚表皮、毛囊外根鞘及毛母質(zhì)細胞。綜上所述,BMP2、BMPR-ⅠA和Noggin的特征性表達,提示BMP2和BMPR-ⅠA對牦牛毛囊休止期的維持具有重要的調(diào)控作用,而Noggin可能對牦牛毛囊的生長具有重要的調(diào)控作用,其主要是通過影響皮膚上皮細胞的增殖和分化來發(fā)揮作用。(3)雙氫睪酮(Dihydrotestosterone,DHT)和雌二醇(17β-estradiol,E_2)是潛在的調(diào)控人毛囊生長的性激素,其分別在5α還原酶(5α-reductase,5α-red)和芳香化酶(Aromatase)的催化作用下催化睪酮(Testosterone,T)產(chǎn)生。為明確牦牛毛囊是否有性激素合成酶及受體的表達,本試驗采用免疫組織化學(xué)、qRT-PCR和Western blotting法對毛囊休止期、生長期和退行期皮膚內(nèi)DHT和E_2合成相關(guān)蛋白以及受體的表達進行檢測,發(fā)現(xiàn)5α-red1、5α-red2和雄激素受體(Androgen receptor,AR)均表達于上皮細胞,并且在毛乳頭中也檢測到AR的表達。同時,5α-red1 mRNA在毛囊各個時期中的轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于5α-red2mRNA;并且5α-red1和5α-red2蛋白最高表達水平分別見于毛囊生長期和休止期,而AR蛋白僅在毛囊生長期表達。此外,Aromatase及雌激素受體α和β(Estrogen receptorαandβ,ERα和ERβ)均在皮膚上皮細胞中表達,并且在真皮乳頭中也有ERα和ERβ的表達。另外,ERαmRNA在毛囊各個時期的轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于ERβmRNA;并且從退行期到休止期,Aromatase和ERβ蛋白的表達呈下調(diào)趨勢,而ERα蛋白呈上調(diào)趨勢。DHT相關(guān)蛋白的特征性表達可能表明,牦牛皮膚細胞中可能存在DHT的合成途徑及作用機制,并且其可能對毛囊的生長具有重要的調(diào)控作用;而E_2相關(guān)蛋白的表達趨勢,提示牦牛皮膚細胞中可能存在E_2的合成途徑及其受體的作用機制,并且E_2可能對牦牛毛囊的退化具有重要的調(diào)控作用。綜上所述,(1)TGF-β2可能通過TGF-βRⅡ的介導(dǎo)途徑,參與調(diào)控牦牛毛囊的退化過程;而HSP70可能通過參與保護細胞免受凋亡來影響牦牛毛囊的生長;(2)BMP2和BMPR-ⅠA能夠通過影響牦牛皮膚上皮細胞的增殖和分化來參與調(diào)控牦牛毛囊休止期的維持,而Noggin則可能通過影響牦牛皮膚上皮細胞的增殖,從而在毛囊休止期-生長期的轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要的調(diào)控作用;(3)牦牛皮膚細胞中存在DHT的合成途徑以及作用機制,并且其可能對毛囊的生長具有重要的調(diào)控作用;牦牛皮膚細胞中同樣存在E_2的合成途徑及其受體作用機制,并且E_2可能對牦牛毛囊的退化具有重要的調(diào)控作用。這為深入研究上述因子在牦牛毛囊生長周期中的作用及其作用機制提供理論依據(jù),也為進一步揭示牦牛對高原特殊環(huán)境的適應(yīng)機制提供有力支撐。
【圖文】：

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文 TGF-β、BMP2 和性激素相關(guān)蛋白對牦牛毛囊周期的調(diào)控研究異極顯著。2 結(jié)果2.1 TGF-β mRNA 在牦牛毛囊生長中期、生長晚期及退行期皮膚中的轉(zhuǎn)錄水平通過 qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，TGF-β1、TGF-β2 及 TGF-β3 mRNA 在毛囊生長中期、生長晚期及退行期皮膚內(nèi)均有表達（圖 1A C）。并且 TGF-β2 mRNA 在毛囊生長中期、生長晚期及退行期皮膚內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于同時期皮膚內(nèi)TGF-β1 和 TGF-β3 mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平（圖 1E）。

Figure 1 Levels of TGF-β mRNA in mid-anagen, late-anagen, and catagen yak skin HFs. (A D) PCR electrophoresis results of TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, and β-actin expression. (E) Relativeexpression of TGF-β1, TGF-β2, and TGF-β3 mRNA in mid-anagen, late-anagen, and catagen yakskin HFs. Values indicate the mean ± SEM, n = 3. M: marker. **P < 0.01 indicate significantdifferences versus TGF-β1 and TGF-β3 in the same period.2.2 TGF-β2 和 TGF-βRⅡ在牦牛毛囊不同時期皮膚內(nèi)的表達2.2.1 TGF-β2 和 TGF-βRⅡ在牦牛毛囊不同時期皮膚內(nèi)的免疫組織化學(xué)檢測TGF-β2 和 TGF-βRⅡ在牦牛毛囊不同時期皮膚中的表達結(jié)果如圖 2 所示。其中，TGF-β2 的陽性表達見于毛囊生長中期的皮膚表皮、毛囊外根鞘、毛母質(zhì)細胞（圖 2A C）以及退行期毛囊的表皮鏈（圖 2D）中。TGF-βRⅡ的陽性表達部位與 TGF-β2 的表達部位一致，其陽性表達也見于皮膚表皮、毛囊外根鞘、毛母質(zhì)（圖 2G I，生長中期）及表皮鏈（圖 2F，，退行期）中。
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S823.85

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