【摘要】：豬在長期的進(jìn)化和選擇過程中,形成豐富多樣的品種,不同品種的生長速度、體型外貌和繁殖性能各不相同。對繁殖力強(qiáng)、抗逆性強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)良性狀的挖掘?qū)︷B(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展意義重大。基因組水平的結(jié)構(gòu)變異能夠影響基因的功能,以致影響個體表型性狀,在物種進(jìn)化中也起著重要作用。采用基因組重測序方法,測定18頭貴州地方豬種的基因組序列,包括香豬、柯樂豬、黔北黑豬、江口蘿卜豬和關(guān)嶺豬,并從公共數(shù)據(jù)庫下載36頭豬的重測序數(shù)據(jù),利用生物信息學(xué)方法在全基因組水平比較貴州地方豬種和其它中國地方豬種、歐洲豬種之間的差異,從基因組水平上揭示品種間不同表型性狀的遺傳變異。通過研究,篩選香豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的重要候選基因,初步揭示產(chǎn)仔數(shù)調(diào)控的分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1.54頭豬基因組結(jié)構(gòu)變異的生物信息學(xué)分析對18頭貴州地方豬(香豬、柯樂豬、關(guān)嶺豬、黔北黑豬、江口蘿卜豬)進(jìn)行基因組重測序,另從公共數(shù)據(jù)庫下載36頭豬的基因組重測序數(shù)據(jù),54頭豬共得到1215.58 Gb的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。利用Pindel和Soft SV軟件分析54頭豬的基因組數(shù)據(jù),在全基因組水平鑒定出39166個結(jié)構(gòu)變異。隨機(jī)選取81個結(jié)構(gòu)變異進(jìn)行PCR驗證,證明這81個結(jié)構(gòu)變異真實存在。結(jié)構(gòu)變異大部分位于基因的間隔區(qū)和內(nèi)含子區(qū)域,僅543個結(jié)構(gòu)變異位于基因的外顯子區(qū)域和UTR區(qū)域;基因發(fā)生結(jié)構(gòu)變異的數(shù)量與基因產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系,表明結(jié)構(gòu)變異可能是基因轉(zhuǎn)錄本可變剪接的原因之一。分析結(jié)構(gòu)變異中的功能元件,大部分結(jié)構(gòu)變異含有轉(zhuǎn)座元件(transposable element,TE)。經(jīng)主成分分析,基因組結(jié)構(gòu)變異能夠?qū)⒉煌z傳背景的豬種區(qū)分開來,提示結(jié)構(gòu)變異可能影響豬的進(jìn)化。2.不同豬品種特有的結(jié)構(gòu)變異及相關(guān)基因功能分析與其它豬種比較,貴州地方豬種的結(jié)構(gòu)變異數(shù)量是歐洲豬種的1.9倍。貴州地方豬種鑒定出1956個特有結(jié)構(gòu)變異影響1628個蛋白編碼基因,其中93個基因可能受結(jié)構(gòu)變異的影響失去功能,這些基因多與豬的繁殖能力相關(guān)。全部受影響的1628個蛋白編碼基因除了富集在類固醇激素受體結(jié)合、雌激素受體結(jié)合、催產(chǎn)素受體信號通路、視黃酸受體結(jié)合等繁殖相關(guān)通路外,還富集于軸突導(dǎo)向、膽堿能突觸通路和m TOR信號通路等,提示這些結(jié)構(gòu)變異可能是貴州豬適應(yīng)能力強(qiáng)和繁殖力低的原因。從貴州豬種X染色體上鑒定出一個20 Mb的熱點區(qū)域,含有29個基因,涉及組蛋白修飾和繁殖過程。3.貴州豬種基因組特有結(jié)構(gòu)變異分析五個貴州豬種共享5944個結(jié)構(gòu)變異,同時也存在品種特有的結(jié)構(gòu)變異�？聵坟i(KL)特有870個,黔北黑豬(QB)特有823個,關(guān)嶺豬(GL)特有825個,蘿卜豬(LB)特有786個,香豬(XP)特有5855個。我們發(fā)現(xiàn)XP擁有數(shù)量最多的特有結(jié)構(gòu)變異,LB特有結(jié)構(gòu)變異的數(shù)量最少。PCA分析表明第一特征向量可將地緣不同的GL、LB和KL、QB、XP區(qū)分開;第二特征向量可區(qū)分XP和KL、QB、LB、GL,提示XP與另外四個貴州豬種之間具有一定的遺傳距離。對這些特有結(jié)構(gòu)變異影響的基因進(jìn)行功能注釋,KL富集在ATP酶活性方面,LB主要富集于離子通道,QB富集在神經(jīng)系統(tǒng)和谷氨酸通路,GL富集的條目主要與肌肉發(fā)育相關(guān),而XP顯著富集于繁殖、生長和脂肪合成相關(guān)的通路。同時香豬中鑒定出51個與生長發(fā)育相關(guān)的候選基因,包括APOD、INO80、IGF2BP3、GSK3B、AKT3和MEF2C等。這些特有結(jié)構(gòu)變異對貴州豬種的生長繁殖力表型差異有一定影響,而且影響豬品種的進(jìn)化過程。4.香豬高產(chǎn)仔數(shù)性狀候選基因位點的鑒定利用比較基因組方法研究高產(chǎn)香豬組和低產(chǎn)香豬組之間結(jié)構(gòu)變異的差異,從高產(chǎn)組鑒定出4637個特有結(jié)構(gòu)變異覆蓋1697個基因;低產(chǎn)組鑒定出4119個特有結(jié)構(gòu)變異影響1582個基因。這些基因主要富集于發(fā)育和繁殖相關(guān)的通路。隨機(jī)挑選50個結(jié)構(gòu)變異進(jìn)行群體檢測,有14個結(jié)構(gòu)變異與香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān),包括XPsv23253(ACSL3)、XPsv04986(TMEM131)、XPsv05574(ADCY3)、XPsv06937(HMGCS2)、XPsv14754(NAMPT)、XPsv02083(JAK2)、XPsv06229(RSPO2)、XPsv25406(LBP)、XPsv10370(LEXM)、XPsv12437(KLF3)、XPsv14802(PDIA4)、XPsv18294(SH3BP5)、XPsv26859(WNK3)和XPsv13280(STPG2);有3個結(jié)構(gòu)變異(XPsv13280,XPsv10370和XPsv14802)DD缺失基因型產(chǎn)仔數(shù)低于II插入基因型,其余11個結(jié)構(gòu)變異DD基因型產(chǎn)仔數(shù)高于II基因型。這14個結(jié)構(gòu)變異可以作為香豬產(chǎn)仔數(shù)的候選分子標(biāo)記。5.結(jié)構(gòu)變異對PDAI4基因表達(dá)的影響利用重測序數(shù)據(jù)分析得到PDIA4基因內(nèi)含子1(9:109266872-109267147)存在一個結(jié)構(gòu)變異(XPsv14802),其中含有一個短散在元件(short interspersed element,SINE)。利用PCR和一代測序證實此結(jié)構(gòu)變異真實存在。群體檢測表明,SINE+/+基因型產(chǎn)仔數(shù)比SINE-/-基因型的產(chǎn)仔數(shù)高1.45頭,與產(chǎn)仔數(shù)有一定的相關(guān)性(P=0.003)。利用軟件Reg RNA2.0預(yù)測,此SINE元件包含外顯子剪接增強(qiáng)子、外顯子剪接沉默子、內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子等,表明此結(jié)構(gòu)變異對PDIA4轉(zhuǎn)錄本的可變剪接可能有一定的影響。采用熒光定量PCR方法,比較不同基因型PDIA4在香豬卵巢中的m RNA表達(dá)水平,結(jié)果表明SINE-/-、SINE-/+基因型的表達(dá)水平明顯高于SINE+/+基因型的表達(dá)水平;經(jīng)Western Blot檢測,SINE-/+、SINE-/-基因型的相對蛋白表達(dá)量也明顯高于SINE+/+基因型(P0.05)。推測SINE元件的存在可能抑制PDIA4基因的轉(zhuǎn)錄過程,負(fù)調(diào)控基因PDIA4在豬卵巢中的表達(dá),影響PDIA4蛋白的表達(dá)水平。上述結(jié)果表明PDIA4基因可以作為香豬產(chǎn)仔數(shù)的分子標(biāo)記。綜上,本研究利用二代測序技術(shù)對5個貴州地方豬品種進(jìn)行全基因組測序,構(gòu)建了貴州豬品種基因組結(jié)構(gòu)變異圖譜,確定了貴州豬品種基因組結(jié)構(gòu)變異的染色體分布,鑒定出一些結(jié)構(gòu)變異很有影響基因的功能元件。對產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的結(jié)構(gòu)變異進(jìn)行群體驗證,獲得14個結(jié)構(gòu)變異可作為產(chǎn)仔數(shù)的候選分子標(biāo)記。這些研究內(nèi)容對貴州地方豬品種的遺傳特征、品種的形成和進(jìn)化等解析具有重要的意義。
【圖文】：

種產(chǎn)區(qū)采取有效的保護(hù)措施，同時由于產(chǎn)區(qū)引入長白豬等外來豬種進(jìn)行雜交，導(dǎo)致地方豬種數(shù)量減少。目前代表的貴州地方豬種有香豬、柯樂豬、黔北黑豬、江口蘿卜豬和關(guān)嶺豬（附圖1；圖1.1）。貴州地方豬種屬于西南型豬，主要特點是肉質(zhì)較好，抗逆性強(qiáng)，但其產(chǎn)仔數(shù)較低。

1.2.3.3 復(fù)制叉延遲和模板轉(zhuǎn)換（fork stalling and template switching，F(xiàn)oSTeS）SNP芯片極大促進(jìn)人們對結(jié)構(gòu)變異的認(rèn)識，但很多結(jié)構(gòu)變異含有復(fù)雜的重排結(jié)構(gòu)基于DNA重組的模型無法給予解釋。因此，提出FoSTeS模型（圖1.3c）來解釋基因重排現(xiàn)象（Lee et al., 2007）。DNA復(fù)制叉受到阻止時，導(dǎo)致滯后鏈從模板上脫落，由微同源序列轉(zhuǎn)移到另一個復(fù)制叉重新合成DNA。新的復(fù)制叉在復(fù)制起點的位置不同則可能導(dǎo)致發(fā)生缺失或者重復(fù)。此模型可以導(dǎo)致大片段結(jié)構(gòu)變異的產(chǎn)生，引起基因水平或外顯子的重排，在基因組進(jìn)化中起重要的作用。微同源序列介導(dǎo)的斷裂誘導(dǎo)復(fù)制模型（MMBIR）是一種類似于FoSTeS模型的機(jī)制，但是它需要微同源序列作為介導(dǎo)，將一段DNA的復(fù)制叉與另一段DNA雙鏈斷裂處形成新的復(fù)制叉并延伸復(fù)制，，從而形成一段新的序列，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變異的形成（Zhang et al., 2009）。圖1.3 結(jié)構(gòu)變異的形成機(jī)制（Weischenfeldt et al.
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S828

【參考文獻(xiàn)】

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