發(fā)布時(shí)間：2020-06-02 07:00

【摘要】：丁酸梭菌(Clostridium butyricum),是一種專性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性芽胞桿菌,也稱酪酸菌。丁酸梭菌及其代謝物能促使乳酸菌等多種腸道有益菌的增殖,抑制大腸桿菌等病原菌的增殖,亦可防治腸道內(nèi)微生態(tài)區(qū)系的紊亂,同時(shí)還能降解多糖類物質(zhì)。本文研究了丁酸梭菌對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制、腸道炎癥因子和抗菌肽表達(dá)的影響、腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響,為改善動(dòng)物的健康狀況提供參考。論文分為三個(gè)部分。試驗(yàn)一:丁酸梭菌的代謝及對(duì)大腸桿菌鞭毛基因和毒力基因表達(dá)的影響。試驗(yàn)采用丁酸梭菌MIYAIRI II 588分別在有氧和無(wú)氧的環(huán)境用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h取樣測(cè)定短鏈脂肪酸(SCFA)。同時(shí)用LB肉湯培養(yǎng)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC),與不同濃度(106 cfu/m L、107 cfu/m L、108cfu/m L)丁酸梭菌共培養(yǎng),在1 h、2 h、4 h、6 h、12 h時(shí)取樣進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,檢測(cè)其鞭毛蛋白基因fae G的表達(dá)變化,同時(shí)檢測(cè)2h時(shí)各組大腸桿菌毒力基因est A、est B的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,(1)無(wú)氧環(huán)境下丁酸梭菌培養(yǎng)液中的乙酸、丙酸、異丁酸、戊酸、異戊酸在不同的時(shí)間點(diǎn)中均無(wú)顯著性差異(P0.05),丁酸到8 h之前為0.015 mmol/L~0.031mmol/L,12 h為0.462mmol/L(P0.01)。24 h以后丁酸含量極顯著的提高至8.213~9.173mmol/L(P0.01)。有氧環(huán)境下丁酸梭菌培養(yǎng)液中的丁酸在12 h前有增長(zhǎng)趨勢(shì)但并無(wú)顯著性差異(P0.05),24 h顯著增長(zhǎng)到0.109 mmol/L(P0.01),到36 h極顯著增長(zhǎng)到6.561 mmol/L(P0.01);(2)在對(duì)照組中ETEC的fae G相對(duì)表達(dá)量在不同時(shí)間都在一個(gè)較高的水平,加入106 cfu/m L、107 cfu/m L、108 cfu/m L的丁酸梭菌后,fae G表達(dá)量都出現(xiàn)了顯著的下降的趨勢(shì)(P0.05),同時(shí),共同作用2 h后,丁酸梭菌顯著的抑制了產(chǎn)毒基因(est A、est B)的表達(dá)(P0.01)。試驗(yàn)二:丁酸梭菌對(duì)ETEC攻毒肉雞生長(zhǎng)性能、腸道炎癥反應(yīng)相關(guān)因子和抗菌肽基因表達(dá)的影響。試驗(yàn)選用健康的1日齡肉雞200只,在1~3日齡階段,分別進(jìn)行如下處理:(1)隨機(jī)選擇100只,每天灌喂1 m L生理鹽水;(2)另外100只灌喂1m L濃度為109 cfu/m L的丁酸梭菌。于7日齡階段,生理鹽水處理肉雞分成:(1)對(duì)照組(Control),(2)大腸桿菌組(EC);丁酸梭菌處理肉雞分成:(3)丁酸梭菌組(CB),(4)丁酸梭菌+大腸桿菌組(CB+EC),其中EC組和CB+EC均分別灌喂1m L 108cfu/m L ETEC菌液進(jìn)行攻毒,而Control組和CB則灌喂1m L生理鹽水。分別在肉雞3、5、7、10、14和28日齡稱重,并在攻毒后翻肛檢查雞群的下痢情況。并ETEC攻毒后的第3和7 d(即10和14日齡)屠宰取腸道組織。結(jié)果顯示:(1)在7~10 d時(shí)CB組的料重比顯著降低(P?0.05)。14日齡時(shí)CB組、CB+EC組與對(duì)照組相比,體重分別提高了19.78%(P?0.05)、20.63%(P?0.05)。(2)對(duì)于回腸組織的炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)水平,10日齡時(shí)(即攻毒后第3 d)TNFα、IL-1β各組間無(wú)顯著性差異(P0.05)。與EC組和EC+CB組比較,CB組IL-8和TLR4基因的表達(dá)量顯著降低(P?0.05),而IL-10基因的表達(dá)量顯著升高(P?0.05)。在14日齡時(shí)(即攻毒后第7 d),TNFα、IL-1β、IL-8的表達(dá)量在各組間無(wú)顯著性差異(P0.05)。CB組IL-10的表達(dá)量顯著高于與EC組(P?0.05),而Control組和CB組TLR4的表達(dá)量顯著低于EC組與CB+EC(P?0.05)。(3)對(duì)于回腸組織抗菌肽基因的表達(dá)水平,10日齡時(shí)(即攻毒后第3 d)Av BD9和Cath-B1表達(dá)量在各組間無(wú)顯著性差異(P0.05),Av BD10在CB組中表達(dá)量極顯著高于其他處理組(P0.01)。在14日齡時(shí)(即攻毒后第7 d),Av BD9的表達(dá)量在CB組與EC組中顯著增加(P0.01),Cath B1表達(dá)量相對(duì)于Control組在其余各組中均顯著增加(P0.01)。(4)在盲腸組織中,在10日齡時(shí)Av BD9基因的表達(dá)量在各組間無(wú)顯著性差異(P0.05),Cath-B1的基因表達(dá)量Control組顯著高于CB+EC組,而CB組Av BD10基因表達(dá)量顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(P0.05)。在14日齡時(shí),CB組與CB+EC組的Av BD10基因表達(dá)量均顯著高于Control組與EC組(P0.05),Av BD9與Cath-B1基因的表達(dá)量在各組間無(wú)顯著性差異(P0.05)。試驗(yàn)三:丁酸梭菌對(duì)大腸桿菌攻毒肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)及短鏈脂肪酸譜的影響。取試驗(yàn)二中所采集的盲腸內(nèi)容物用于高通量測(cè)序分析菌群結(jié)構(gòu),并將回腸和盲腸內(nèi)容物用于短鏈脂肪酸含量測(cè)定。結(jié)果顯示,(1)10日齡時(shí)(即攻毒后第3 d),在門水平上,厚壁菌門(Firmicutes)為各組的優(yōu)勢(shì)菌門,相對(duì)豐度均在93%以上。在屬水平上,乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、毛螺菌屬(Lachnospiraceae)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、丁酸球菌屬(Butyricicoccus)魏斯氏菌屬(Weissella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)為優(yōu)勢(shì)菌屬;乳酸桿菌屬相對(duì)豐度最高。在14日齡時(shí)(即攻毒后第7 d),厚壁菌門同樣也是各組的優(yōu)勢(shì)菌門,相對(duì)豐度均在76%以上。屬水平上,乳酸桿菌屬(Lactobacillu)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、毛螺菌屬(Lachnospira)、柔嫩梭菌屬(Faecalibacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、丁酸球菌屬(Butyricicoccus)、Blautia、芽孢桿菌屬(Bacillus)為優(yōu)勢(shì)菌屬。由于優(yōu)勢(shì)菌群不同,10 d、14 d的菌群結(jié)構(gòu)有一定差異。(2)回腸中SCFAs含量降低,10 d時(shí)乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸在各組的含量分別為0.138~0.175mg/g、0.014~0.017mg/g、0.012~0.016mg/g、0.049~0.074mg/g;14 d時(shí)乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸在各組的含量分別為0.104~0.169mg/g、0.012~0.016mg/g、0.003~0.006mg/g、0.063~0.084mg/g,且各組間差異不顯著(P0.05)。在盲腸中,10日齡時(shí)CB組乙酸含量顯著高于其他試驗(yàn)組(P0.01),CB組和CB+EC組丁酸含量顯著高于Control組和EC組(P0.01);14日齡時(shí),CB組乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸含量均顯著高于Control組和EC組(P0.05)。綜上所述,在體外條件下,丁酸梭菌可抑制大腸桿菌毒力基因和粘附基因的表達(dá)。在肉雞試驗(yàn)中,丁酸梭菌早期干預(yù)可以在一定程度上降低大腸桿菌攻毒肉雞腸道中的炎癥反應(yīng)和提高抗菌肽基因的表達(dá)促進(jìn)腸道菌群的生產(chǎn)短鏈脂肪酸,從而減少大腸桿菌引起的下痢,通過(guò)基于OTU水平的主成分分析發(fā)現(xiàn),丁酸梭菌早期干預(yù)可以在一定程度上改變盲腸的菌群結(jié)構(gòu)。
【圖文】：

圖 2.1 標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間Fig 2.1 The retention time of standard substance菌處理大腸桿菌使用 MRS 培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng) 24h，大腸桿菌使用 LB 培養(yǎng)基培養(yǎng) 別稀釋到 109cfu/mL、108cfu/mL、107cfu/mL，大腸桿菌稀釋到 10u/mL、108cfu/mL、10^7cfu/mL 的丁酸梭菌分別加入 108cfu/mL 大放入密閉的離心管中分別培養(yǎng) 1h、2h、4h、6h、12h 時(shí)取樣。7放入-80℃保存，后進(jìn)行熒光定量 PCR。菌鞭毛基因及毒力基因熒光定量 PCR加入 1ml TRIzol Reagent，劇烈振蕩，然后加入 0.2 mL 氯仿。

圖 2.2 丁酸梭菌對(duì)大腸桿菌鞭毛蛋白基因表達(dá)的影響Fig 2.2 The effect of Clostridium butyricum on gene expression of flagellin in escherichia coli.2.2.3 丁酸梭菌對(duì)大腸桿菌毒力基因表達(dá)的影響如圖 2.3 所示，在 2h 時(shí)，同時(shí)加入大腸桿菌和丁酸梭菌培養(yǎng)后，大腸桿菌毒力estA、estB 的表達(dá)量相對(duì)于大腸桿菌單獨(dú)處理組均出現(xiàn)了極顯著降低（P<0.01）。不同濃度的丁酸梭菌添加量發(fā)現(xiàn)，108CFU 丁酸梭菌添加量對(duì)兩個(gè)產(chǎn)毒基因的抑制最顯著（P<0. 01），而 EC +CB 106組對(duì)大腸桿菌 estA 與 estB 基因的抑制效果顯著EC+CB 107組和 EC+CB 108組（P<0.05），并且隨著丁酸梭菌濃度增加抑制效果越顯
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S831.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2692785