【摘要】：狂犬病病毒(RABV)是彈狀病毒科狂犬病毒屬的一種單股負(fù)鏈RNA病毒,能引起人和動物發(fā)生高度致死性狂犬病。病毒粒子由核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、糖蛋白(G)和大蛋白(L)組成。N、P、L蛋白包裹病毒RNA基因組構(gòu)成核糖核蛋白復(fù)合物(RNPs),N蛋白與基因組RNA結(jié)合,能夠保護(hù)病毒RNA免于被降解;M蛋白與包膜下的RNPs相互作用,有助于病毒粒子組裝;G蛋白能夠識別細(xì)胞表面受體,在RABV與胞膜融合及胞內(nèi)運輸過程中起重要作用。盡管對RABV研究眾多,但微管和馬達(dá)分子對RABV胞內(nèi)感染的影響還有待深入研究。本研究首先使用微管抑制劑Nocodazole預(yù)處理N2a細(xì)胞,然后進(jìn)行RABV感染。分別采用RT-qPCR、Western blot檢測RABV N基因及蛋白表達(dá)量,通過免疫熒光觀察Nocodazole處理對RABV在N2a細(xì)胞的感染率及上清中病毒TCID_(50)滴度的影響,研究微管在RABV感染中的作用。隨后N2a細(xì)胞感染RABV12 h后,用Nocodazole處理,收集不同處理時間樣品,進(jìn)行RT-qPCR、TCID_(50)檢測,分析病毒出胞時間及微管對病毒出胞過程的影響。為驗證dynein分子馬達(dá)在RABV感染中的作用,通過特異性抑制劑Na_3VO_4處理或馬達(dá)復(fù)合物亞基成分的重組質(zhì)粒pcDNA4.0-myc-CC1和pcDNA3.1-flag-p50轉(zhuǎn)染細(xì)胞,檢測RABV N基因、蛋白表達(dá)量及上清病毒滴度,評價dynein在RABV感染中的作用。另外,還通過轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-KHCct,檢測了分子馬達(dá)kinesin-1在RABV感染中的作用。通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志蛋白CNX、PDI與RABV結(jié)構(gòu)蛋白共定位來檢驗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是否參與RABV感染。結(jié)果顯示,Nocodazole預(yù)處理抑制了微管形成,使RABV N基因拷貝數(shù)降低約25%、N蛋白降低約50%,病毒感染率降低約70%,上清液中病毒滴度由10~(6.5)TCID_(50)/mL下降至10~(4.5)TCID_(50)/mL,說明狂犬病病毒胞內(nèi)感染依賴于微管骨架的參與。RABV感染后用微管抑制劑處理也得出相似結(jié)論。Na_3VO_4預(yù)處理抑制dynein,RABV N基因降低約60%、N蛋白降低約45%,病毒感染率降低約75%,上清病毒滴度由10~(7.5)TCID_(50)/mL降至10~(5.5)TCID_(50)/mL,說明狂犬病病毒胞內(nèi)感染依賴于逆向運輸分子馬達(dá)dynein參與。重組質(zhì)粒pcDNA4.0-myc-CC1、pcDNA3.1-flag-p50的表達(dá)均可競爭性抑制dynein功能,N基因分別降低約75%、40%,N蛋白降低約50%、70%,單細(xì)胞內(nèi)病毒感染率均顯著減少,上清液中病毒滴度分別由10~(7.5)TCID_(50)/mL降至10~(5.5)TCID_(50)/mL、10~(7.0)TCID_(50)/mL降至10~(5.75)TCID_(50)/mL。胞內(nèi)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-KHCct競爭性抑制了kinesin-1功能,RABV N基因降低約25%、N蛋白降低約25%,細(xì)胞內(nèi)病毒感染顯著減少,上清病毒滴度由10~(6.75)TCID_(50)/mL降至10~(5.5)TCID_(50)/mL,證明RABV胞內(nèi)感染也依賴于分子馬達(dá)kinesin-1。應(yīng)用抗RABV G蛋白抗體染色,發(fā)現(xiàn)ER標(biāo)志蛋白CNX、PDI與RABV G蛋白有明顯共定位。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn),RABV P蛋白也與ER標(biāo)志蛋白CNX、PDI有明顯共定位。以上結(jié)果表明,RABV感染N2a細(xì)胞需要微管及馬達(dá)分子dynein、kinesin-1運輸系統(tǒng)的參與,其中以dynein的作用更大。初步結(jié)果顯示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與RABV G蛋白、P蛋白的胞內(nèi)復(fù)制。本實驗為進(jìn)一步研究RABV胞內(nèi)感染及裝配細(xì)節(jié)奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

期內(nèi)體（LE）[20]、循環(huán)內(nèi)體途徑（RE）。此后，病毒 RNPs 脫殼被釋放到細(xì)胞中[40]。在“病毒加工工廠”——尼氏小體內(nèi)以 RABV RNPs 為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄復(fù)制1]，G 蛋白通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）、高爾基體（Golgi）途徑合成，而其他病毒蛋白可能是在位于包涵體近端的游離核糖體上合成[42]。病毒粒子在尼氏體上完成裝后出芽到胞外[9]。

兩個扇形尾部構(gòu)成，其尾部與輕鏈結(jié)合[70]。通過頭部的 ATP 結(jié)合位點結(jié)合并水解 ATP，導(dǎo)致頸部構(gòu)象改變，且兩個頭部的微管結(jié)合位點分別交替與微管結(jié)合實現(xiàn)“行走”（如圖 2）。兩條重鏈的尾部連接兩條輕鏈的 N-末端疏水性的七肽重復(fù)序列，輕鏈 C-末端 TPR 結(jié)構(gòu)域（34 aa）與運載物的結(jié)合，從而將結(jié)合的物質(zhì)（運輸囊泡或細(xì)胞器）轉(zhuǎn)運到特定位置。其運輸方向為微管正端（+），介導(dǎo)貨物從細(xì)胞中心向外周沿微管進(jìn)行正向運輸。Kinesin-1 是分布最廣泛的驅(qū)動蛋白之一，有利于細(xì)胞質(zhì)中微管依賴性的正向物質(zhì)運輸[76]。Kinesin-1 屬于 N-Kinesin 蛋白，由球狀頭部、扇形尾端及中間重鏈桿狀構(gòu)成。生化研究表明，Kinesin-1 N-端具有運動結(jié)構(gòu)域，在重鏈 C-末端（KHC）具有一個微管結(jié)合位點[77]。其可以在神經(jīng)和非神經(jīng)細(xì)胞中沿微管定向運動，還可競爭性抑制 dynein 介導(dǎo)貨物由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細(xì)胞核進(jìn)行負(fù)向運輸[78, 79]。在 Vero 細(xì)胞中過表達(dá) Kinesin-1 重鏈 C-末端片段（KHCct）的實驗表明，，KHCct（residues 771-963）可以通過結(jié)合 Kinesin 運動結(jié)構(gòu)域抑制 Kinesin 活性[79]。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S855.3

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