【摘要】：目的:犬博卡病毒(Minute virus of canines,MVC)是一種體積小,無(wú)包膜、能夠自主復(fù)制的單鏈DNA(ssDNA)病毒,是犬類(lèi)多種疾病發(fā)生的病原體。氧化苦參堿(Oxymatrine,OMT)作為苦參的主要有效成分之一,具有抗炎抗病毒、抗腫瘤、抗心律失常和抗纖維化等功效。尤其在抗病毒方面,對(duì)于多種病毒都具有抵抗作用。本研究中,我們主要通過(guò)觀察氧化苦參堿(Oxymatrine,OMT)對(duì)犬博卡病毒(MVC)感染引起的沃爾特里德犬(Walter Reed canine cell/3873D,WRD)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期與活力的變化以及對(duì)病毒基因的復(fù)制和表達(dá)、病毒顆粒形成的影響,以此來(lái)探究OMT體外抗犬博卡病毒的作用。方法:首先,以0.5mM至20mM(mmol/L)系列濃度的OMT孵育WRD細(xì)胞72h,采用CCK-8法確定氧化苦參堿使用的安全劑量,并以MVC感染W(wǎng)RD細(xì)胞建立感染模型,在安全劑量的干預(yù)下檢測(cè)氧化苦參堿對(duì)感染細(xì)胞活力的影響;其次,以4mM(安全劑量濃度)的OMT對(duì)感染的細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),一方面采用Southern blot檢測(cè)氧化苦參堿對(duì)病毒基因組DNA復(fù)制的影響,同時(shí)分別采用Western blot和qRT-PCR技術(shù)對(duì)病毒基因NS1、NP1和VP2的蛋白以及mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),比較OMT干預(yù)組與病毒組,觀察氧化苦參堿對(duì)病毒基因表達(dá)的影響,另一方面采用免疫熒光法觀察病毒顆粒的形成;與此同時(shí),流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的變化,以及凋亡相關(guān)基因Caspase-3的激活和Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果:1.病毒感染復(fù)數(shù)一定(MOI:10)時(shí)感染細(xì)胞,不同OMT濃度(0.5mM至20mM)進(jìn)行干預(yù),與感染組相比,干預(yù)組中感染細(xì)胞的活力值明顯升高(~(**)P0.01);病毒感染復(fù)數(shù)不同(MOI:2.5、5、10、20、40、80),以一定濃度的OMT(安全劑量4mM)對(duì)感染細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),與感染組相比,隨著病毒感染復(fù)數(shù)不斷增大,細(xì)胞活力降低(~*P0.05)。2.與感染組相比,加入OMT進(jìn)行干預(yù)后,病毒基因組DNA的復(fù)制和病毒基因NS1、VP2和NP1表達(dá)水平明顯降低(~*P0.05),病毒顆粒的形成明顯減少。3.相較于感染組,在感染早期,OMT干預(yù)組中S期阻滯明顯縮短,在感染后期,細(xì)胞凋亡明顯減少(~(**)P0.01)。4.與感染組相比,加入OMT進(jìn)行干預(yù)后,凋亡因子Caspase-3的激活產(chǎn)物的表達(dá)降低(~*P0.05),抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)增強(qiáng)(~(**)P0.01)。結(jié)論:1.OMT能夠顯著提高M(jìn)VC感染靶細(xì)胞的細(xì)胞活力,使細(xì)胞凋亡減少并保護(hù)細(xì)胞,發(fā)揮抗MVC活性的作用。2.OMT能夠抑制病毒基因組DNA的復(fù)制、病毒基因的表達(dá)、病毒顆粒的形成以及縮短感染早期S期的阻滯。3.OMT減少感染細(xì)胞的凋亡,可能與抑制凋亡因子Caspase-3的激活,增強(qiáng)抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。
【圖文】：

士學(xué)位論文 結(jié) 果堿使用安全劑量的確定濃度為 0.5、1、2、4、5、8、10、15、20 mmol/L（mM）的氧育 72 h 后，采用 CCK-8 實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示， 0.5、1、2、4 和 5mM 時(shí)細(xì)胞活力均高于正常對(duì)照組，說(shuō)明 5m堿溶液為安全使用劑量；當(dāng)濃度升高到 10mM 時(shí)，細(xì)胞活力值低了半數(shù)致死濃度（CC50）。因此，我們選取 10mM 以下不同濃度抗病毒實(shí)驗(yàn)的研究。

寧夏醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 結(jié)果減弱， 表明 4mM 濃度以下 OMT 具有抗病毒作用（圖 2A）。因此，我們確定 4mM 氧化苦參堿濃度作為抗病毒的最佳安全劑量，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中我們選取 4mM 的 OMT 濃度進(jìn)行研究。為了觀察 OMT 對(duì)不同 MOI 病毒感染細(xì)胞后細(xì)胞活力變化的影響，以不同感染復(fù)數(shù)的病毒液（MOI: 2.5、5、10、20、40、80）感染細(xì)胞，安全劑量濃度的 OMT（4mM）進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與感染組相比，病毒感染復(fù)數(shù)值為 5 和 10 時(shí)，MVC/OMT 干預(yù)組的細(xì)胞活力升高（**P<0.01），，隨著 MVC 感染復(fù)數(shù)的增加，OMT 抑制病毒能力減弱（*P<0.05）（圖 2B）。表明 OMT 對(duì)低感染復(fù)數(shù)的病毒有很好的抑制作用，增強(qiáng)感染細(xì)胞的細(xì)胞活力，對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S853.7

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10 袁[

本文編號(hào)：2692730