【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染會引起機體免疫功能紊亂、免疫抑制,多種病原繼發(fā)感染和混合感染,給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的損失。PCV2持續(xù)性感染導致豬群的血清抗體陽性率居高不下,接種疫苗產生的抗體與自然感染產生的抗體無法有效區(qū)分,這是目前疫苗免疫防控面臨的最大挑戰(zhàn)。鑒于此,本研究通過監(jiān)測豬群中IgG和IgM抗體的動態(tài)變化規(guī)律,發(fā)現PCV2特異性IgM抗體的存在時間和存在狀態(tài)在區(qū)分疫苗免疫和病毒感染方面發(fā)揮重要作用,基于此,分別建立了基于SPG的檢測PCV2 IgG抗體的捕獲ELISA和以抗豬IgM多抗為捕獲抗原的檢測PCV2 IgM抗體的捕獲ELISA方法,綜合兩種抗體診斷方法的判定結果可為判斷豬群感染狀態(tài)和疫苗接種時機提供科學指導。研究內容可分為以下三個部分:1.分析PCV2感染和免疫后豬群產生的IgG和IgM抗體消長規(guī)律利用PCV2商品化滅活疫苗和細胞分離毒株分別免疫和感染抗體陰性豬,接種后定期采集外周血并分離血清,進口試劑盒INGEZIM IgG/IgM Kit檢測血清樣品。通過監(jiān)測抗體的消長變化,發(fā)現免疫和感染后IgM抗體首先產生,隨后轉變?yōu)镮gG抗體,且持續(xù)存在;人工感染PCV2細胞毒產生的IgM存在時間為20-30 d,自然感染(感染組的陽性對照)產生的IgM持續(xù)55 d,而接種滅活疫苗的免疫組IgM的存在時間不超過14 d。PCV2 IgM抗體產生特點可以優(yōu)化免疫程序,區(qū)分病毒感染和疫苗免疫,首先免疫前應該避開IgM抗體陽性期;免疫后若IgM抗體變?yōu)殛幮?在下次接種疫苗之前若檢測結果為陽性,那么必定出現了新一輪的PCV2感染,此時不建議追加免疫。2.基于SPG建立檢測PCV2 IgG的捕獲ELISA通過比較SPA、SPG和PPL三種免疫球蛋白結合蛋白作為捕獲抗原、HRP標記的PCV2 Cap作為二抗的捕獲法ELISA,確定SPG為包被抗原,優(yōu)化反應條件,繪制ROC曲線確定臨界值(cut-off point,cut-off值)為0.61,此時對應的敏感性和特異性分別為93.9%和90.3%。187例臨床樣本的檢測結果顯示,該方法與商業(yè)化的INGEZIM Circovirus IgG Kit的總符合率為96.23%。3.建立捕獲ELISA檢測PCV2 IgM抗體以兔抗豬native IgM高免血清做包被抗原,HRP標記的R2346作為二抗,建立檢測豬抗PCV2IgM抗體的ELISA方法。優(yōu)化該方法的最佳反應條件后,繪制ROC曲線判定cut-off值為0.492,對應的敏感性和特異性分別為96.7%和97.2%;檢測田間血清樣品IgM與INGEZIM IgM Kit試劑盒符合率為92.7%。本研究分別建立檢測PCV2 IgG和IgM抗體的捕獲ELISA,為優(yōu)化疫苗免疫程序、PCV2的早期快速診斷和區(qū)分病毒感染和疫苗免疫提供了簡單有效的途徑,為進一步控制PCV2在豬場中的流行傳播提供了可靠依據。
【圖文】：

圖 2.1 部分標準血清的 IFA 結果Fig 2.1 Partial reference serum immunofluorescence results3.2.2 PCV2 Cap 蛋白的表達及鑒定通過SDA-PAGE證實PCV2 Cap重組蛋白在大腸桿菌中成功表達，鎳離子柱純化效果較好（圖2.2）。Western blot 顯示抗體能夠識別純化的 Cap 蛋白，說明具有反應原性（圖 2.2）。

圖 2.2 PCV2 Cap 蛋白的 SDS-PEGE 和 Western Blot 分析Fig 2.2 SDS-PAGE and Western Blot analysis of PCV2 Cap0 kDa)；1 和 2：IPTG 未誘導和誘導后的重組 PCV2 Cap；3：t。Marker(10-170 kDa); Line1 and Line2: Uninduced and IPTG-induap; Lane 4: Western Blot of purified proteins.件的優(yōu)化明，無論 OD450還是 P/N 值均顯示 SPG 為最佳捕獲875 ng(1:800)，血清的最佳稀釋度為 1:80（圖 2.3 和圖 0.5 h、1 h 和 2 h，結果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，表 2.1）。Akerstrom 等人曾報道 SPG 與 IgG 在 30-4使 16.5 h 后，它仍在緩慢上升(Akerstrom and Bjorck,為 1 h（圖 2.5a）。此外，緩沖溶液的 pH 值對 SPG 結合而，這一結論與以前的報告不一致(Akerstrom and B，，這表明 SPG 能夠很好地適應反應環(huán)境的酸堿度。因
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S852.4

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本文編號：2692703