【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的高度接觸性傳染病,其主要特征為母豬繁殖障礙、新生仔豬死亡率升高以及各年齡豬呼吸道癥狀。PRRS于1995年傳入我國,現(xiàn)已成為現(xiàn)代化養(yǎng)豬場最重要的傳染病,特別是2006年以來流行的高致病性PRRSV給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前PRRS主要靠弱毒活疫苗免疫進(jìn)行控制,盡管對同源毒株感染的免疫保護(hù)效果較好,但對異源毒株感染的免疫保護(hù)效果存在爭議,而且存在毒力返強(qiáng)和病毒擴(kuò)散風(fēng)險。PRRSV是變異最快的RNA病毒之一,具有復(fù)雜的感染及免疫逃逸機(jī)制,新型疫苗研制面臨巨大挑戰(zhàn),迫切需要研究抗病毒感染的新策略。PRRSV主要感染豬單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng),參與感染的病毒受體主要有兩個,其中CD163是病毒感染巨噬細(xì)胞的核心受體,其第5-9個清道夫受體半胱氨酸富含結(jié)構(gòu)域(SRCR5-9)含PRRSV結(jié)合區(qū);唾液酸粘附素(Sn)輔助病毒吸附和進(jìn)入靶細(xì)胞,其前4個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(Sn4D)為PRRSV結(jié)合區(qū)。本課題組的前期研究結(jié)果證明,重組腺病毒表達(dá)的Sn4D-Fc和SRCR59-Fc游離受體能阻斷PRRSV感染豬肺巨噬細(xì)胞(PAM),兩個游離受體具有抗感染協(xié)同作用。然而,這些重組腺病毒能否在豬體內(nèi)有效表達(dá)游離受體及其能否抵抗PRRSV感染有待進(jìn)一步研究。為此,本課題開展表達(dá)游離受體重組腺病毒的體內(nèi)抗PRRSV感染研究。1.PRRSV游離受體捕捉蛋白表達(dá)、純化和活性檢測鏈球菌G蛋白(SPG)是IgG結(jié)合蛋白,其C2結(jié)構(gòu)域能與多種哺乳動物IgGFc片段結(jié)合。類彈性蛋白多肽(ELP)是新型重組蛋白純化標(biāo)簽,具有溫度敏感的可逆相變特性,其融合蛋白可用溫控離心法純化。為了建立Sn4D-Fc和SRCR59-Fc游離受體捕捉與檢測方法,本研究構(gòu)建SPG C2與ELP編碼序列融合表達(dá)載體pELP-C2,將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BLR(DE3),用IPTG誘導(dǎo)ELP-C2融合蛋白表達(dá),對可溶性融合蛋白表達(dá)及其純化的可逆相變循環(huán)(ITC)條件進(jìn)行了優(yōu)化。研究結(jié)果顯示:37℃條件下重組菌能表達(dá)可溶融合蛋白ELP-C2,但表達(dá)水平較低;0.lmM IPTG足以誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),表達(dá)水平具有溫度和時間依賴性,26℃誘導(dǎo)30h的表達(dá)水平最高;離心沉淀ELP-C2融合蛋白的ITC條件為32℃和3M NaC1,兩輪ITC純化的ELP-C2融合蛋白純度大于90%;Western-blot鑒定結(jié)果顯示ELP-C2融合蛋白能與豬等哺乳動物IgG和雞IgY結(jié)合,為建立Sn4D-Fc和SRCR59-Fc游離受體濃縮與檢測方法奠定了基礎(chǔ)。2.PRRSV游離受體檢測方法建立和體內(nèi)表達(dá)檢測鑒于ELP-C2融合蛋白也能與雞IgY結(jié)合,本研究先以容易獲得的雞IgY為對象摸索利用ELP-C2融合蛋白濃縮及純化Ig的條件。試驗結(jié)果顯示,ELP-C2能從粗制卵黃抗體中有效捕捉IgY,其最佳結(jié)合條件為16℃和125μg/mL融合蛋白,IgY能從蛋白復(fù)合物中有效洗脫,最佳洗脫條件為用pH 9.5的0.1M甘氨酸在28℃洗脫5min。在此結(jié)合和洗脫條件下,利用ELP-C2融合蛋白能從重組腺病毒感染PK-15細(xì)胞培養(yǎng)中濃縮和純化Sn4D-Fc和SRCR59-Fc游離受體,其純度分別為93.1%和94.3%。以純化的Sn4D-Fc為抗原,以小鼠抗豬Sn免疫血清為包被抗體,以生物素標(biāo)記豬Sn多克隆抗體為第二抗體,建立了定量檢測豬Sn的雙抗體夾心ELISA方法,檢測靈敏度為0.4ng/mL。最后分別將重組腺病毒rAd-Sn4D-Fc和rAd-SRCR59-Fc注射仔豬,定期采集豬血分離血清,經(jīng)ELP-C2捕捉濃縮后,分別用建立的ELISA方法和商品試劑盒檢測Sn4D-Fc和SRCR59-FC融合蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示重組腺病毒接種豬能分泌表達(dá)兩種游離受體,表達(dá)持續(xù)15天左右。3.PRRSV接觸感染仔豬模型建立為了模擬PRRSV自然感染和用于游離受體攻毒保護(hù)效果評價,將易感仔豬與JXA1株P(guān)RRSV人工感染仔豬在隔離器中進(jìn)行同居飼養(yǎng),每日觀察記錄體溫變化和臨床癥狀,定期采集血清和糞便樣品,用熒光定量RT-PCR檢測病毒血癥和糞便排毒水平;對病死豬和試驗結(jié)束撲殺豬進(jìn)行剖檢和病理學(xué)檢查,用熒光定量RT-PCR檢測病毒載量和組織分布。結(jié)果顯示:接觸感染仔豬于同居后第4天出現(xiàn)體溫升高,第5天出現(xiàn)PRRS癥狀,分別較人工接種豬推遲2和3天;第7天出現(xiàn)PRRS典型癥狀,癥狀計分與人工接種豬接近;第3天起為血清檢測PRRSV陽性,第10天病毒血癥上升至較高水平(8.6 logl0/mL);第5天起為糞便檢測PRRSV陽性,第7天起糞便排毒上升至較高水平(3.9 logl0/0.lg);3頭接觸感染仔豬分別于同居后第12和13天死亡,較人工接種豬推遲1-2天;接觸感染病死仔豬的主要器官病毒載量以及大體和顯微病理變化與人工接種病死豬相似。這些研究結(jié)果表明,建立的接觸感染仔豬模型可用于PRRS疫苗免疫效果評價。4.游離受體對JXA1株P(guān)RRSV感染的阻斷作用為了評價游離受體的攻毒保護(hù)作用,根據(jù)血清RT-PCR和ELISA檢測結(jié)果選擇PRRSV易感仔豬9頭,分別肌肉注射4×109TCID50重組腺病毒rAd-Sn4D-Fc(n=3)、rAd-SRCR59-Fc(n=3)和 rAd-Sn4D-Fc+rAd-SRCR59-Fc(n=3)。在注射后第 5 天,分組與JXA1株P(guān)RRSV人工感染豬同居飼養(yǎng),定期觀察臨床癥狀,統(tǒng)計發(fā)病死亡情況,采集血樣和糞樣進(jìn)行PRRSV定量檢測,對病死豬進(jìn)行病理解剖和病毒定量檢測。結(jié)果與感染對照組(n=3)相比,rAd-Sn4D-Fc、rAd-SRCR59-Fc 和 rAd-Sn4D-Fc+rAd-SRCR59-Fc注射組體溫升高時間分別推遲2、3和5天,臨床癥狀出現(xiàn)時間分別推遲3、3和4天;感染組仔豬于第12、13天全部死亡,rAd-Sn4D-Fc注射組分別于第23、24、25日死亡,rAd-SRCR59-Fc注射組第23天死亡1頭,死亡豬具有PRRS典型病變,而rAd-Sn4D-Fc+rAd-SRCR59-Fc注射組無豬死亡;將死亡豬和幸存豬撲殺后剖檢,rAd-Sn4D-Fc注射組仔豬肺臟水腫、出血,有明顯間質(zhì)性肺炎,rAd-SRCR59-Fc和rAd-Sn4D-Fc+rAd-SRCR59-Fc注射組肺臟無明顯肉眼病變,僅見少量壞死灶,病理切片顯示肺泡壁輕微增厚;同居感染后病毒血癥和糞便排毒檢出時間分別比感染組推遲2、2、4天和2、2、5天;重組腺病毒注射組仔豬各器官病毒載量均低于感染組,并且rAd-Sn4D-Fc + rAd-SRCR59-Fc注射組最低,其次為rAd-SRCR59-Fc注射組。這些研究數(shù)據(jù)表明,重組腺病毒表達(dá)的Sn和CD163游離受體對高致病PRRSV具有不同程度抗感染作用,Sn游離受體的抗病毒感染作用較弱,CD163游離受體的抗病毒感染作用較強(qiáng),兩者具有抗感染協(xié)同作用,這與先前報道的體外研究結(jié)果一致,也與CD163是PRRSV主要受體、Sn是PRRSV次要受體的結(jié)論相符。5.游離受體對不同毒株P(guān)RRSV感染的阻斷作用為了驗證兩種游離受體對不同毒株P(guān)RRSV的感染阻斷作用,選擇PRRSV易感仔豬6頭,肌肉注射重組腺病毒rAd-Sn4D-Fc+rAd-SRCR59-Fc(各2×109TCID50)。在注射后第5天,每組3頭分別與高致病PRRSV臨床分離株SH1705和JS07感染豬同居飼養(yǎng),按照上述方法進(jìn)行抗病毒效果評價。結(jié)果與JS07和SH1705株感染對照組相比,rAd-Sn4D-Fc+rAd-SRCR59-Fc注射組仔豬體溫升高時間分別推遲4天和8天;臨床癥狀出現(xiàn)時間均推遲2天,第7-17天rAd注射組癥狀計分顯著低于JS07感染組(P0.05),第7-20天rAd注射組癥狀計分顯著低于SH1705感染組(P0.05);JS07和SH1705感染組均有1頭仔豬死亡,死亡豬肺臟紅腫、出血,呈現(xiàn)典型間質(zhì)性肺炎,rAd注射組無死亡,撲殺后肺部無明顯病變;rAd注射組的病毒血癥檢出時間比JS07和SH1705感染組均推遲4天;rAd注射組的糞便排毒檢出時間比JS07和SH1705感染組均推遲3天;rAd注射組仔豬脾、肺和淋巴結(jié)的病毒載量顯著低于JS07感染組(P0.05),脾、肺、腎和淋巴結(jié)的病毒載量顯著低于SH1705感染組(P0.05)。這些研究資料表明,聯(lián)合注射表達(dá)Sn和CD163游離受體的重組腺病毒能有效阻斷不同PRRSV毒株感染,可以作為PRRS預(yù)防或治療性疫苗進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S858.28

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本文編號：2692077