生長分化因子 8(growth differentiation factor 8,GDF-8)又稱肌肉生長抑制素(myostatin,MSTN)是一種肌肉生長負反饋因子,主要在骨骼肌中高水平表達。GDF-8基因自然或人工突變的動物都表現(xiàn)出骨骼肌過度肥大的現(xiàn)象,肌肉含量顯著增加,對肉畜養(yǎng)殖業(yè)具有重大的經(jīng)濟價值�；蚓庉嫾夹g(shù)是研究基因功能的一種重要方法。近年來,CRISPR-Cas系統(tǒng)憑借其靈活、便捷、快速、耗費低的特點廣泛應(yīng)用在多種動植物的基因編輯中。CRISPR-Cas系統(tǒng)是來源于古細菌中的一種核酸酶與非編碼小RNA構(gòu)成的復(fù)合物,其主要依靠單鏈向?qū)NA(SgRNA)結(jié)合在基因上的特定序列,從而實現(xiàn)對靶向DNA序列位點實行切割,引起DNA雙鏈斷裂(DSBs),繼而在細胞自身DNA修復(fù)機制的作用下,完成基因編輯。本研究運用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對加利福尼亞兔(簡稱兔)GDF8基因進行基因編輯。首先在外源基因上對選定的位點進行編輯效率的驗證,其次在兔成纖維細胞上進行編輯效率的驗證,然后在兔受精卵注射Cas9mRNA和SgRNA,培養(yǎng)至囊胚期進行編輯效率的驗證,最后將顯微注射過的受精卵移植回母兔輸卵管,以期獲得基因編輯兔。主要研究結(jié)果如下:(1)成功構(gòu)建了由hSpCas9真核表達載體和gRNA真核表達載體組成的基因打靶系統(tǒng),且通過在細胞和胚胎層面的檢測驗證了其可以準(zhǔn)確的對靶位點進行基因編輯。(2)在兔GDF8基因上成功篩選到了兩個可以高效結(jié)合gRNA真核表達載體的靶位點E1和E2。通過RGS-CR報告載體在HEK293T細胞轉(zhuǎn)染實驗中的檢測及流式細胞儀的分析,兩個gRNA位點均可高效率的介導(dǎo)形成DSBs,其中g(shù)RNAE1的效率達到了 64.0%,gRNAE2的效率略高于E1,達到了 64.4%。(3)成功分離到了兔原代成纖維細胞,并運用構(gòu)建的打靶系統(tǒng)在兔成纖維細胞上實現(xiàn)了對GDF8基因的編輯。T7E1酶切鑒定結(jié)果表示gRNAE1在成纖維細胞上的編輯效率為27.1%,gRNAE2在成纖維細胞上的基因編輯效率為7.4%。測序結(jié)果表明gRNAE1的編輯效率達到了 45.3%,gRNAE2在兔成纖維細胞上的基因編輯效率為25.0%(4)運用構(gòu)建的打靶系統(tǒng)在兔一細胞期胚胎上成功實現(xiàn)了對GDF8基因的編輯。選用雙位點基因打靶的策略,通過體外轉(zhuǎn)錄獲得hspCas9mRNA和sgRNA,然后按100:50ng/μL的濃度比顯微注射到兔一細胞期胚胎中,并培養(yǎng)至囊胚期,通過巢式PCR擴增進行測序驗證,測序結(jié)果表明,gRNAE1和gRNAE2共同打靶在兔內(nèi)源胚胎上的編輯效率達到了 20.0%。(5)運用構(gòu)建的打靶系統(tǒng)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因兔,本次一共移植了 28枚胚胎至兩只母兔,十天后通過觸診判斷兩只均妊娠,其中一只在孕期21天時流產(chǎn),流出了 6只死胎,另一只在孕期23天時流產(chǎn),流出3頭死胎。剪取這九只死胎的大腿肌肉組織,提取組織基因組,進行PCR擴增以及測序驗證。測序結(jié)果表明,未在靶位點檢測到基因突變的現(xiàn)象。
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并且推測肌肉生長抑制素的氨基酸序列具有推定的氨基末端信號序列，ＴＧＦ－Ｐ逡逑前肽結(jié)構(gòu)域，，ＲＸＸＲ蛋白水解加工位點，ＴＧＦ－Ｐ結(jié)構(gòu)域和１２個保守的半胱氨酸逡逑殘基，且肌肉生長抑制素基因在四種檢查的１０種組織和器官中表達￥（圖１－１）。逡逑ＧＤＦ８Ｇ＾ｍ—邐邐—逡逑Ｉ邋＼邐／邐＼邋Ｚ邋＼逡逑！、、、、、、、丨、、、、、、、／邋丨逡逑ＭＳＴＮ邋Ｊ逡逑圖１－１邋ＧＤＦ８基因及ＭＳＴＮ蛋白結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＧＤＦ８邋ｇｅｎｅ邋ａｎｄ邋ＭＳＴＮ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑２基因編輯技術(shù)研究進展逡逑在基因功能研宄領(lǐng)域，基因編輯技術(shù)是一項重要的研[偡椒�。近年来，辶x希茫遙剩櫻校遙茫幔螅瓜低稱窘杵淞榛�、便绞n⒖燜�、耗酚�(xùn)偷奶氐愎惴河τ迷詼嘀侄插義銜锏幕蟣嗉�。在Ｃ＿b桑櫻校遙茫幔螅瓜低秤糜諢蟣嗉�，锌重搼Z崦福ǎ椋睿沐義希媯椋睿紓澹蟈澹睿酰悖歟澹幔螅澹�，ＺＦＮｓ）和转录激烩侚效�σ蜃雍慫崦福ǎ簦潁幔睿螅悖潁椋穡簦椋錚鑠澹幔悖簦椋觶幔簦錚潁歟椋耄邋義希澹媯媯澹悖簦錚蟈澹睿酰悖歟澹幔螅澹�，邋ＴＡＬＥＮｓ）是主要的基蚁l嗉ぞ�。诊喗种方法均矣[滌詰鞍資跺義媳鳶形壞�，因此，峨s誆煌陌形壞閾枰杓撇煌牡鞍�，试褭┸普C�，而且花辶x戲呀細�。蠂D雜謖飭街只蟣嗉椒�，Ｃ＿b桑櫻校遙茫幔螅辜際踉蛞攬康氖牽櫻紓遙危潦跺義媳鳶形壞



本文編號：2691896